体细胞重编程的动力学测量与实时可视化

这些实验方案的总体目标是可视化并追踪体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSC）的进程。该方法可用于解答iPSC领域中的关键科学问题，例如：所使用的体组织类型、应用的重编程技术以及培养基质与培养基组合如何影响重编程的动力学特征和重编程效率。该方法的主要优势在于利用细胞表面标志物来观察体细胞向iPSC转变的过程，从而能够实时监测重编程事件。

转导后第七天，每孔加入两毫升 DPBS 洗涤成纤维细胞，并每孔加入 0.5 毫升 37 摄氏度的 0.5% EDTA，在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。当细胞变圆后，每孔加入两毫升 37 摄氏度的成纤维细胞培养基终止反应，并轻轻吹打每孔底部，使细胞脱落。将每孔中的成纤维细胞转移至各自的 15 毫升锥形管中，通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于2毫升新鲜的37摄氏度成纤维细胞培养基中，并对每种培养条件下的细胞进行计数。接着，将1×10⁵个细胞接种至六孔组织培养板中预先准备好的无饲养层条件培养孔中，在细胞培养孵育箱中过夜培养。次日，用适用于细胞应用的适当培养基替换每个孔中的原有培养基。

然后将培养板放入成像仪中，设置软件在接下来的14天内每6至8小时对每个孔进行一次连续的全孔相差和荧光图像采集。重编程实验结束时，用2毫升37摄氏度的DMEM/F12培养基洗涤各孔一次。弃去洗涤液，随后在培养箱中，以37摄氏度向每孔加入1毫升新鲜DMEM/F12培养基中含有适当一抗的溶液，孵育45分钟以标记细胞。

孵育结束后，用37摄氏度的DMEM/F12培养基洗涤细胞两次。弃去洗涤液后，在37摄氏度条件下，加入1毫升适当稀释的二抗溶于37摄氏度DMEM/F12培养基中，标记细胞30分钟。孵育结束后，再用DMEM/F12培养基洗涤细胞两次。

然后将每孔中的洗涤液更换为2毫升新鲜的37摄氏度DMEM/F12培养基。将培养皿放入成像仪中，并打开成像软件。在成像系统软件中设置扫描时，首先选择要使用的托盘位置，并选择要扫描的培养皿类型。

接下来，选择全孔成像模式、用于扫描目标孔的扫描模式，以及用于实时识别目的表面标志物的适当荧光通道。然后为待扫描的实验进行标记，并设置每天对样品进行扫描的时间点和时间间隔。要分析一组已扫描的实验，请选择感兴趣的实验，然后选择“启动新分析任务”。

然后根据成像所用通道选择相应分析类型的适当处理定义，例如 PSC 相位克隆计数。为分析任务命名，并选择分析的时间范围以及待分析的孔。

然后启动分析任务。为了从单个孔中测量所需的重编程时间点，用两毫升 DPBS 对目标孔洗涤一次，随后弃去洗涤液，并加入一毫升预热至 37 摄氏度的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。

在37摄氏度孵育5分钟后，将胰蛋白酶吹打至孔底以使细胞解离成单细胞悬液，并将细胞转移至15毫升锥形管中。用3毫升DPBS洗涤孔中残留的细胞，并将其收集至15毫升离心管中。向细胞中再加入10毫升DPBS，通过离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于1毫升DMEM/F12培养基中用于计数。然后将细胞悬液稀释至每毫升6×10⁵个细胞的浓度，并按所需样本数量每管分装1毫升细胞。接着，在室温下用含感兴趣的一抗的1毫升DMEM/F12培养基避光孵育30至45分钟，期间轻轻混匀。

孵育结束后，用37摄氏度的DMEM/F12培养基洗涤细胞两次。将细胞沉淀重悬于1毫升DPBS中，并将样品分别转移至单独的FACS管中。获取重编程培养板的流式细胞术图谱。

然后将FCS文件转移至计算机，并将文件导入相应的分析软件中。在前向散射光与侧向散射光的散点图中打开第一个对照文件，并将y轴设置为对数刻度。随后在活细胞群体周围创建一个多边形门。

接下来，利用活细胞绘制侧向散射面积对散射高度的散点图，并设置一个矩形门以排除双联体细胞。然后使用这些门控在相应的荧光通道下分析实验样本文件，以在各自的象限中鉴定目标细胞群体。使用仙台病毒重编程BJ成纤维细胞生成SSEA4+CD44-细胞的效率与重编程DF1成纤维细胞不同，表明通过早期比较多能干细胞样SSEA4+CD44-细胞所占百分比，可用于追踪重编程进程。

在流式细胞术时间序列分析中，CD24-CD44+ 且 EpCAM 阴性的 CD44+ 成纤维细胞会形成双阴性群体，随后分别转变为 CD24+CD44- 和 EpCAM 阳性的 CD44- 多能干细胞样细胞，进一步描绘出重编程的进程。对重新接种后的重编程培养物进行实时成像，显示逐渐形成的克隆群落，其汇合度呈对数增长，并在重编程完成时表现出最终的多能性标志物阳性及成纤维细胞标志物阴性表达。此外，利用报告基因可在相差显微镜下测量汇合度，观察到 GFP 汇合度的增长较总汇合度更为缓慢。

事实上，在本项代表性实验中，第19天的GFP汇合度不到总汇合度的一半，对应于完全重编程的状态。一旦掌握该技术，即可用于阐明重编程事件的相关信息，并追踪人类成纤维细胞重编程的动力学过程。该技术还可用于研究不同的起始体细胞组织、所采用的重编程技术以及培养基与基质组合，以深入解析重编程过程。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用实时监测和细胞表面标志物表达，来追踪人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的过程。