利用实时直接分析高分辨质谱法快速高通量鉴定植物材料物种

本实验的总体目标是利用常压电离质谱法鉴定植物材料的物种。结合多元统计分析，该方法有助于解答化学与生物学领域的关键问题，例如，根据植物的化学指纹图谱确定其所属物种。

此外，您还可以获得有关植物组织中生物活性分子的信息。该技术的主要优势在于，分析所需的样品前处理步骤极少，且数据可在几分钟内获取。该方法也可用于解决化学领域的其他问题。

例如，在有机合成中追踪反应中间体和产物、分析不同类型的复杂基质以及进行顶空分析。为制备 kratom 新鲜叶片材料，使用直径为六毫米的打孔器，从 M. speciosa 植物中制备均匀的 kratom 叶片小片。重复此过程五次。

在1.5毫升微量离心管中进行操作，取少量巴厘 kratom 粉末，加入1毫升乙醇与水按1:1配制的溶剂混合液，悬浮粉末。重复此步骤五次。将所得巴厘 kratom 粉末提取液样品置于超声水浴中，在室温下超声处理30分钟。

然后，在室温下以750 × g离心 kratom Bali 粉末提取物样品2分钟。倾去残余粉末中的溶剂，用于后续分析。制备曼陀罗种子时，使用剃刀刀片沿横切面将 D.stramonium 种子切成两半。

使用五种不同的种子重复此过程。按照文本方案中所述设置质谱仪或质谱参数后，在质谱仪控制软件中点击“开始运行”，以分析 kratom 叶片。用镊子将 kratom 植物材料的碎片夹持在离子源与质谱仪进样口之间，直至获得质谱图。

使用不同的植物材料样品重复此步骤五次。使用聚乙二醇600（简称PEG）校准质谱，将熔点毛细管的封闭端浸入PEG标准品中。将涂覆后的毛细管置于离子源与质谱仪进样口之间悬挂。

单击停止按钮以结束分析运行。在质谱仪控制软件中按“开始运行”以分析干燥的 kratom 叶片。用镊子将少量干燥的叶片材料悬置于离子源与质谱仪进样口之间，直至获得谱图。

每次分析新的植物材料，重复采集五次。使用PEG校准光谱，方法同前，然后选择“停止”按钮以结束分析运行。要分析 kratom 粉末，请在质谱仪控制软件中点击“开始运行”。

将熔点毛细管的封闭端浸入 kratom 粉末中。将涂有样品的毛细管置于离子源与质谱仪进样口之间，直至获得质谱图。每次使用新的毛细管重复分析五次，随后进行 PEG 校准。

为了分析 kratom 提取物，将毛细管的一端浸入提取物中。将毛细管悬置于质谱仪线性轨道上的12个样品支架中。每次使用不同的提取物重复该步骤五次。

在质谱仪控制软件中点击“开始运行”。使用控制面板，选择前进按钮，以每秒一毫米的速度推动线性轨道穿过离子流，以采集谱图。使用聚乙二醇（PEG）对谱图进行校准，然后点击“停止”以结束分析运行。

为分析曼陀罗种子，请在质谱仪控制软件中点击“开始运行”。用镊子将曼陀罗种子的一半固定在离子源与质谱仪进样口之间，直至完成谱图采集。确保切面朝向离子源。

重复此步骤五次，每次分析一颗新的种子半粒。使用 PEG 标准品完成校准，然后按“停止”以结束分析运行。按照文本方案进行数据处理后，转到光谱分析软件“设置”选项卡下的“分类”部分，通过选择“添加类别”创建数据处理类别，进而执行主成分分析。

通过选择“添加文件”来导入数据的文本文件。通过选择“文本文件”并为所选文件“设置类别”，将数据文件分配给相应的植物类别。从训练集的质谱数据中选择用于区分的特征质荷比，并将阈值百分比设为1%。接下来，设置质荷比容差为10，并选择“从数据文件构建向量”。

在“计算”部分，勾选“3D PCA 图”复选框以进行主成分分析，并点击“计算”。选择“验证”以执行留一交叉验证。然后，转至光谱分析软件的“频谱图”选项卡，选择“热图”以生成数据的热图。

选择“阈值”保存的数据，将丰度阈值设为1%。通过选择“将热图保存为Excel”导出热图至电子表格。在电子表格程序中，将导出的热图另存为文本文件。然后，将热图作为文本文件导入Cluster 3.0软件，以进行层次聚类分析。

在 Cluster 3.0 的“Hierarchical”选项卡中，于“Genes and Arrays”复选框下勾选“Cluster”和“Calculate weights”。将截断值设为 0.1，指数设为 1。选择单连接聚类以执行分析。

最后，在 Java 树状视图中查看生成的 cdt 数据文件。此处展示了 kratom 产品的代表性软电离正离子模式质谱图。已鉴定出先前从 M. speciosa 中分离出的化合物。

包括精神活性生物标志物 kratom 碱（Mitragynin）和 7-羟基-kratom 碱（7-Hydroxy-mitragynine）。此处展示了曼陀罗种子的代表性软电离正离子模式质谱图。鉴定出先前从曼陀罗中分离出的化合物，包括精神活性生物标志物阿托品（Atropine）和东莨菪碱（Scopolamine）。

此处展示了质谱数据的热图渲染结果。图中显示了 kratom 与 datura 数据的主成分分析（PCA）图。该 PCA 图清晰地表明，kratom 数据与 datura 数据彼此之间得到了良好的分离。

PCA分析还表明，可以识别并区分不同种类的 kratom 以及不同物种的曼陀罗。图中显示了 kratom 和曼陀罗质谱数据的层次聚类分析（HCA）结果。HCA分析结果表明，仅基于实时高分辨质谱直接分析所得数据，即可实现分类、物种及品种的区分，并证实了PCA分析的结果。

一旦掌握，若操作得当，根据样本数量的多少，该技术可在一小时之内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用直接分析与实时质谱技术来分析复杂样品，并通过数据的统计分析处理获得物种信息。在实施该步骤时，重要的是将样品在离子流中保持适当的时间，以获取样品完整的质谱图。

该技术已使植物组学、法医学、有机化学和分析化学等多个领域的研究人员能够探索植物释放的挥发性物质，鉴定可引发药物反应的合法替代物，并实时监测反应产物。