小鼠犁鼻器急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析

本实验的总体目标是对来自小鼠副嗅球急性组织切片中特定感觉神经元群体进行单细胞电生理分析。该方法有助于阐明化学感应领域中的关键问题，例如非视觉化学检测的机制。该技术的主要优势在于，通过对急性组织切片中的感觉神经元进行记录，可以在这些细胞的天然环境中对其进行研究。

开始此操作时，先处死动物，然后将一把大型手术剪从口腔内插入，分别剪断两侧的下颌骨及肌肉，以取下下颌。接着，使用中号镊子去除上颌及鼻尖周围的皮肤，以便更好地暴露门齿。然后使用骨剪以45度角朝吻端方向剪除门齿的大部分，以方便从鼻腔中取出犁鼻器囊。

不要切割牙齿的根部，以防止损伤犁鼻器囊的尖端。随后，用中号镊子夹住硬腭的吻侧部分，以平缓的角度小心地一次性向后剥离。用冰冷的S2溶液反复冲洗鼻腔。然后使用微型弹簧剪剪开犁骨尖端与下颌之间的骨质渗出物。

将剪刀尖端插入，使弯曲部分朝向远离犁鼻器（VNO）的方向，沿VNO囊两侧外侧，分小步仔细剪切骨骼。为取出VNO囊，于其尾侧切断犁骨，并用中号镊子小心将犁骨从鼻腔中提起并移除。

立即将犁鼻器转移至置于冰袋上的体视显微镜下的小型培养皿中，并在此处完成后续解剖步骤。接着，用少量冰冷的S2溶液冲洗犁鼻器，以防止组织干燥。然后，用中号镊子夹住犁鼻软骨后部，分离包裹犁鼻器软组织的软骨囊。

为此，将囊置于背侧视角，使两个犁鼻器（VNO）之间的裂隙可见。用精细镊子的尖端将两侧软骨性VNO囊从中央骨骼分离，同时保持犁鼻骨后部固定。确保之前附着于犁鼻骨的内侧软骨壁已被去除。

去除VNO周围的软骨时，仅需用镊子夹住软骨囊的边缘。务必小心，避免损伤脆弱的感觉上皮。为去除残留的软骨，将VNO弯曲的外侧朝下翻转至培养皿底部，并用镊子牢固地固定住一侧的软骨。

然后，将第二把精细镊子从后方以非常平缓的角度插入软骨与犁鼻器（VNO）之间，小心地松解组织与软骨之间的连接。为避免损伤感觉上皮，应捏住犁鼻器的尾端，缓慢将其从软骨上剥离。一旦犁鼻器从囊膜中撬出，需彻底清除所有残留的小块软骨，因为任何残留的软骨碎片都可能在切片过程中导致组织从周围的琼脂糖中脱落。

接下来，在已解剖的第一例VNO上放置一小滴冰冻的S2溶液，以防止组织受损。为包埋VNO，将两个小培养皿均注满熔化的S3，直至液面与皿口齐平。随后，将每个VNO浸入琼脂糖中，并水平来回移动数次，以去除其表面的细胞外液薄膜及任何气泡。将VNO垂直放置，使其吻端朝向培养皿底部。

随后，将两个培养皿置于冰袋上，等待琼脂糖完全凝固。一旦琼脂糖开始凝固，切勿改变犁鼻器的方向，否则会导致组织与周围琼脂糖脱离。在此步骤中，使用小刮铲将小培养皿中的琼脂糖块转移至大培养皿的盖子中，并将琼脂糖块倒置，使犁鼻器的吻端朝上。

接下来，使用手术刀将组织块切割成金字塔形状，并注意不要损伤包埋的组织。然后，使用超级胶水将呈金字塔形状的组织块固定在振动切片机样品板的中心位置，并等待约一分钟，使胶水完全干燥。

将样本切成150至200微米厚的切片。在解剖显微镜下快速检查切片形态。随后将所有切片转移至充氧 chamber 中，待用。

在此步骤中，将一个VNO切片转移至成像室，并使用带有直径0.1毫米合成纤维的不锈钢锚固定切片位置。切勿用任何合成纤维丝覆盖组织切片。接着，将成像室转移至记录装置，并在室温下持续用充氧的S2溶液对切片进行灌流。

调节吸液毛细管至溶液表面，以实现灌流液的持续交换。然后将八通道一体式多管灌流笔调整至靠近犁鼻器切片非感觉区域（含血管部分）的上方并靠近该区域。随后，使用内含150毫摩尔氯化钾的L形琼脂桥连接参考电极与灌流液。

随后，用移液管溶液 S4 填充膜片移液管。将移液管安装到连接至前置放大器的涂有氯化银的电极上，注意不要刮掉涂层，并牢固固定。在移液管进入浴液前，对其施加轻微的正压。监测移液管电阻，确保其阻值在 4 兆欧姆至 10 兆欧姆之间。

使用CCD相机结合优化的红外微分干涉差（DIC）显微技术观察VNO切片，并通过荧光照明及合适的滤光立方体识别表达FPR-rs3 i-Venus的细胞或类似标记的神经元。使用手轮调节以获得最高灵敏度，接近细胞体。由于施加正压，当移液管尖端靠近细胞体膜时，可在膜表面观察到微小的凹陷。

然后释放正压，施加轻微负压以吸入细胞膜，从而形成1至20吉欧姆的高阻封接。随后施加短暂而轻柔的吸力，破坏细胞膜，建立全细胞记录模式。本图显示的是犁鼻器组织冠状切片的共聚焦图像，展示了荧光FPR-rs3 Tau Venus阳性神经元在犁鼻感觉上皮中的分布情况。

FPR-rs3 Tau Venus阳性神经元表现出单个顶端树突，其末端在管腔边界处形成类似结节的结构。此处展示的是从VSN胞体进行的全细胞膜片钳记录。以下是对TTX敏感的快速激活钠电流以及FPR-rs3阳性VSNs的代表性膜片钳记录轨迹。

在对照条件下进行的电压阶跃记录显示了一种电压依赖性的快速瞬时内向电流。使用1 µM河豚毒素（TTX）处理后，该电流显著减弱。此处所示的数字相减迹线揭示了对TTX敏感的电压门控钠电流。

典型的电流钳记录显示了在逐步施加正负电流刺激时产生的去极化、超极化以及动作电位序列。一旦掌握，双侧犁鼻器的完整解剖和组织切片过程均可在约一小时内完成。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如细胞外松散式膜片钳记录或钙成像，以提高分析大量神经元群体时的实验通量。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从口腔犁鼻器制备急性组织切片，以及如何对犁鼻器感觉神经元进行单细胞电生理记录。