一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

本方法的总体目标是快速且经济地定量脑脊液（CSF）中的多种生物标志物，以评估其在诊断和治疗监测中的应用价值。这是一种新型检测方法，使我们能够测量以往无法检测的生物标志物。我们认为，该方法可用于诊断目的，还可用于区分不同的神经退行性疾病，并可能提供预后信息。

该技术的主要优势在于其设计具有快速、样品制备简单、高度特异性和成本低廉的特点，易于转化为临床实验室应用。该技术的应用前景涵盖治疗与诊断领域，因为这一高通量检测方法可在未来的临床试验中用于神经退行性疾病的新疗法研究。该方法还可应用于其他疾病和组织样本，例如尿液用于肾脏疾病、血浆用于心肌病，以及细胞用于多能性检测。

开始此实验步骤时，根据制造商的说明，将所需合成多肽重悬至一毫克每毫升的储存浓度。从储存液中对多肽进行十倍稀释，并将每种多肽各1,000皮摩尔加入低吸附微量离心管中混合。使用SpeedVac浓缩仪将混合的多肽样品干燥。

完成后，将样品储存在负20摄氏度。接下来，将100微升脑脊液分装至低吸附的微量离心管中。冻干脑脊液样品。

将混合肽样品的等分试样重悬于消化缓冲液中，配制成浓度分别为每微升10皮摩尔和1皮摩尔的溶液。随后，将混合肽样品以0、1、2、5、10和15皮摩尔浓度梯度加入至100微升冻干的脑脊液样品中。然后，加入20纳克完整且无关联的蛋白质，作为内标物并用于监控胰蛋白酶的消化效率。

向脑脊液等分试样中加入消化缓冲液，使最终体积达到 20 µL，并涡旋混匀样品。随后，加入 1.5 µL 二硫苏糖醇，按照标准操作程序在室温下振荡反应一小时。接着，向样品中加入 3 µL 碘乙酰胺，在避光条件下于室温振荡 45 分钟。

然后，加入 165 µL 双蒸水。向样品中加入 10 µL 浓度为 0.1 µg/µL 的测序级修饰胰蛋白酶溶液，该溶液用 50 mmol/L 碳酸氢铵缓冲液重悬。将样品置于 37 °C 水浴中孵育过夜。

然后，通过冷冻样品终止消化反应。将脑脊液消化产物在冰上解冻后，以16,000 × g离心10分钟。离心结束后，将每份消化产物60 µL转移至300 µL玻璃插入瓶中。

使用配备C18 UPLC色谱柱的液相色谱-质谱（LC-MS）系统，采用10分钟、乙腈浓度从1%线性梯度升至40%的洗脱程序，进样标准曲线中最高浓度点。运行完成后，在软件中打开所得色谱图，记录每种肽段的保留时间及其信号强度最高的两个裂解离子对。根据这些信息，更新先前建立的多反应监测（MRM）方法，添加时间分段通道以检测目标肽段。

为了保持灵敏度，每个通道应确保每种肽段至少有一个跃迁的峰每峰点数超过八个，且驻留时间大于 0.01 秒。在质谱方法文件中，通过在方法事件中选择溶剂延迟，将溶剂延迟纳入 MRM 方法中。在短梯度 HPLC 方法中，正确匹配相应的色谱峰至关重要。

可通过使用基质中用于标准曲线的加标肽段，并在方法开发过程中观察多个转化反应来实现。最后，手动审查数据注释以确保准确性。对每个肽段及其与相应的稳定同位素标记内标的比例进行分析。

此处展示了高通量脑脊液（CSF）检测中显著肽类标志物的色谱图。该数据提供了相对于相应稳定同位素标记内标物的标准化比值，可用于确定脑脊液中绝对浓度，并对临床样本中的变化进行统计学分析。对该CSF检测中包含的74种肽段进行定量分析发现，其中25种在痴呆患者脑脊液中发生显著改变，此处展示了痴呆标志物前食欲素（pro-orexin）和YKL几丁质酶-3样蛋白的检测结果。

ApoE4 是阿尔茨海默病的已知风险因素，ApoE 亚型的检测基于检测对应于 E2 和 E4 亚型氨基酸变化的肽段。此处显示了每种亚型组合所预期的质谱峰图。一旦方法建立，若操作得当，该检测可在一天内完成。该方法开发后，已能够以高分析灵敏度和特异性测量一组新的生物标志物，这将使研究人员能够以全新的方式评估神经退行性疾病。

观看本视频后，您应能充分理解如何设计并优化 MRM 检测方法的灵敏度和特异性。请务必注意，操作 DTE、白蚁、甲酸及人体组织时可能存在极高危险性，因此在实验过程中应采取预防措施，例如佩戴手套。