研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

细菌生物膜对人类健康具有重要意义，可保护其内部的细菌免受环境侵害和抗菌剂的作用。本实验的目的是建立一个模型系统，用于评估小分子抑制剂对生物膜形成的影响。这些方法有助于建立一套关键工具，使生物膜研究领域能够筛选出特异性靶向生物膜形成的抑制剂。

这些方法的主要优势在于，它们基于一个一致且稳健的实验框架，能够对生物膜特异性抑制剂的作用机制提供定量和定性的深入理解。尽管这些方法可用于研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的生物膜，但也可应用于其他形成生物膜的细菌，例如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）或植物病原菌柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri）。扫描电子显微镜对于分析小分子对生物膜形成的影响至关重要，因为它能够观察胞外基质，并提供单细胞水平的分辨率。

首先，挑选一个合适的单菌落，将其转移至3 mL LB肉汤中。将该初始培养物置于37摄氏度的摇床培养箱中培养4小时。培养结束后，取1.5 mL初始培养物，离心4分钟。

小心移除上清液，然后将沉淀重悬于 1.5 毫升 MSgg 培养基中。为培养菌膜，取 12 孔细胞培养板，在每个孔中加入 3 毫升 MSgg 培养基。向其中部分孔内加入含有小分子抑制剂的 MSgg 培养基，设置不同浓度梯度，并将不同浓度的处理组在培养板上分散放置，以避免边缘效应。

测量重悬的起始培养物在600纳米处的光密度。培养物的光密度值应在0.6至1.0之间。这对系统的稳健性至关重要。

向培养板的每个孔中接种3 µL重悬的起始培养物。随后，在23 °C下静置培养三天。之后，从培养箱中取出培养板，观察菌膜形成情况。

为了培养生物膜，使用模板在8.5厘米干燥的1.5% MSgg琼脂平板上对称地点加四滴未洗涤的起始培养物，每滴1.5微升。待液滴完全渗入培养基后，再移动平板。将平板置于30°C条件下孵育三天。

使用双目显微镜并在光照均匀的条件下，检查生物膜菌落是否已发育并形成三维皱褶结构。首先，取一把洁净的剃刀刀片，在模板的辅助下将生物膜菌落切成大小相等的两半。用洁净的刮勺小心地挑起其中一半菌落，并转移至含有500 µL PBS的1.5 mL微量离心管中。

取菌落的另一半，转移至含有500微升50%乙醇的微量离心管中。这些样品将用于评估对消毒剂的抗性。随后，同样取经D-赖氨酸处理的菌落的前半部分，放入磷酸盐缓冲液（PBS）中。

然后，取该菌落的另一半，转移至乙醇中。将含有生物膜两半部分的所有试管在室温下孵育10分钟。随后，在18,000 × g 条件下离心5分钟。

使用移液器小心吸去上清液。加入 300 微升 PBS，然后用微探头超声仪在低功率条件下对细胞进行超声处理。再加入 700 微升 PBS，使最终体积为 1 毫升。

接下来，在 PBS 中进行 10⁻⁷ 的系列稀释。取其中一种稀释液 100 µL，接种于 1.5% 琼脂 LB 培养皿中。每份样品重复此步骤，另取两种稀释液进行接种。

使用玻璃珠涂布接种物，然后在30摄氏度下倒置培养平板过夜。观察平板并计数菌落形成单位（CFU）。计算每毫升的CFU数值后，进一步计算PBS处理组与乙醇处理组中的存活率百分比。

开始样品固定时，首先为所需数量的生物膜菌落配制足量的新鲜固定液。向每个培养皿中小心加入5毫升固定液，避免将固定液直接吹打到菌落上。菌落将开始从琼脂上脱离并漂浮起来。

用封口膜小心密封培养板，并在室温下于旋转摇床上孵育两小时。将培养板转移至4°C环境中过夜保存。使用连接真空泵的巴斯德吸管轻轻移除固定液。

加入10毫升含有100纳摩尔二甲胂酸钠和5毫摩尔氯化钙的缓冲液以洗涤生物膜，并孵育5分钟。使用巴斯德移液管小心地将生物膜菌落的中心部分从琼脂平板上分离。为使菌落空气干燥，将纤维素滤纸剪成四等份，然后将其中一份浸入100%乙醇中。

小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移到滤纸上。将滤纸放入铺有干燥滤纸的培养皿中。然后盖上培养皿，置于化学通风橱中过夜干燥。

为了保持生物膜菌落的形态，必须用纤维素纸完全托住漂浮的生物膜。一旦将生物膜置于纸上，便不能再进行调整。先在电子显微镜载样台表面涂上碳导电胶带，然后用镊子小心地将生物膜菌落转移至载样台上。

通过添加一条细小的导电胶带将每个菌落连接到样品台后，将样品台置于干燥器中保存24小时，或保存至需要使用时为止。此步骤需要操作者手部稳定且精确，因为在此阶段，生物膜非常脆弱，容易破裂。挑战在于将生物膜的大部分完整固定，同时避免产生裂纹。

在检查当天，将菌落放入金-钯溅射镀膜仪中。以60度角对样品镀膜两分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转120度。

最后，从上方对样品进行一次三分钟的镀膜处理。样品现已准备好用于扫描电镜成像。这些图像显示了在生物膜诱导型MSgg培养基中培养的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的菌膜形成情况。

加入小分子抑制剂D-lysine后，菌膜的形成受到抑制。随着抑制剂浓度的增加，菌膜的形成呈现相应的减少趋势。该图显示了经D-lysine抑制剂处理或未处理的生物膜菌落中细胞在乙醇暴露下的存活情况。

经 D-赖氨酸处理并暴露于 50% 乙醇 10 分钟的菌落，其存活率相较于未处理组显著降低。自上而下的双目显微图像显示，在 D-赖氨酸存在条件下生长的菌落整体较小，且形成的皱褶不如未处理菌落明显。临界点干燥生物膜菌落的扫描电子显微镜图像进一步揭示了生物膜发育的改变。

胞外聚合物基质（EPS）在未经处理的样品中呈现类似蜘蛛网的结构，而经处理的样品中则显示出较少的有序性。最后，在单个细菌细胞分辨率下的观察显示，经处理的细胞在形态上更长，EPS 覆盖较少，且与邻近细胞的连接不如未经处理的细胞紧密。在进行该实验操作时，重要的是要记住，建立一个一致的研究生物膜抑制剂的框架，对于获得可重复的实验结果至关重要。

一旦掌握，若操作得当，小分子化合物抑制生物膜形成的筛选可在不到一周的时间内完成。在遵循本实验方案的基础上，可进一步开展其他方法，例如对单个生物膜细胞中基因表达的分析，以更深入地了解小分子抑制剂的作用靶点。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析特定生物膜抑制剂对生物膜形成及抗生素耐药性所产生的整体影响。