一种用于检测细胞和组织中RNA N⁶-甲基腺苷修饰的方法

改进的RNA印迹技术的总体目标是检测RNA中的N6-甲基腺苷（n6A）修饰，并在多种RNA中识别这些修饰。该方法有助于解答RNA表观遗传学领域中的关键问题，例如N6-甲基腺苷修饰的功能。该技术的主要优势在于能够有效分离RNA，为实验设计提供更好的标准化，并清晰地界定RNA中的n6A修饰。

该方法可用于研究RNA中的n6A修饰，也可通过使用不同的检测抗体应用于其他RNA修饰。实验开始时，将RNase去污染溶液喷洒在纸巾上，擦拭移液器和实验台表面。再用无核酸酶水浸湿纸巾，再次擦拭移液器和实验台表面。

取预冷至4摄氏度的RNA提取液，向约75毫克小鼠组织中加入1毫升该溶液。使用 overhead 搅拌器匀浆组织。随后，每1毫升样品匀浆液中加入100微升1-溴-3-氯丙烷（BCP）。

剧烈振荡试管15秒，然后进行总RNA提取。使用分光光度计，通过测定260纳米和280纳米处的吸光度来确定RNA浓度。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的质量。

用焦碳酸二乙酯（DEPC）水冲洗所有电泳设备。在锥形瓶中加入2.5克琼脂糖和215毫升DEPC水，用微波炉彻底熔化混合物。溶液熔化后，加入12.5毫升10X MOPS缓冲液。

向烧瓶中加入22.5毫升37%甲醛。然后将溶液倒入带有1.5毫米厚梳子的电泳装置中。使用干净的梳子将气泡推至凝胶边缘。

让凝胶在室温下充分凝固。接着，使用预先配制的1× MOPS电泳缓冲液冲洗凝胶的加样孔，并对凝胶进行预电泳。将RNA样品加入凝胶的加样孔中，然后开始电泳。

第二天，在紫外光下观察并拍摄凝胶图像。为准备转膜，裁剪凝胶并移除未使用的部分。配制500毫升10X盐溶液柠檬酸钠（SSC）缓冲液。

用10倍浓度的SSC缓冲液将凝胶洗涤两次。剪取一张足够覆盖凝胶的滤纸。再剪取四张与凝胶大小相同的滤纸片。

接下来，将一张带正电荷的尼龙膜裁剪成与凝胶相同大小。在凝胶和膜上标记一个缺口，作为方向定位标记，以确保正确的方向。将膜浸泡在2X SSC缓冲液中。

将500毫升10X SSC缓冲液倒入转移槽中。将大片滤纸铺在玻璃板上，并用转移缓冲液浸湿滤纸。然后使用移液管滚压排除任何气泡。

将两片预先裁剪好的滤纸浸入转移缓冲液中，然后放置在滤纸的中央位置，去除任何气泡。接着将凝胶的上表面朝下放在滤纸上，再将膜放置在凝胶上方，注意对齐凝胶和膜上的缺口。

接下来，将两片预先裁剪好的滤纸放在膜的上方，去除各层之间的气泡。用塑料膜包裹凝胶，以确保吸水纸仅吸收穿过凝胶和膜的缓冲液。

然后在滤纸上方叠放纸巾。将一块较大的玻璃板放在纸巾上，并在玻璃板上放置一个重物，使 RNA 在过夜时间内从凝胶转移到膜上。转移完成后，将膜保持在 2X SSC 缓冲液中湿润状态。

将两张滤纸浸入10X SSC缓冲液中，然后将滤纸放入紫外交联仪中。确保RNA吸附面朝上，再将膜放置在滤纸上方。选择自动交联模式，按下启动按钮开始照射。

使用紫外凝胶成像仪检查膜和凝胶，以确认RNA已从凝胶转移至膜上。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温下封闭一小时。随后将膜在4摄氏度下与m6A抗体溶液孵育过夜。

第二天，用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 15 分钟。接着，将膜在室温下与 HRP 标记的驴抗兔抗体溶液孵育一小时。一小时后，再次用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 15 分钟。

加入增强型化学发光底物，使用数字成像仪捕获化学发光信号。最后进行 m6A 定量，利用 ImageJ 软件测量相对 m6A 化学发光强度。小鼠肝脏 RNA 每隔四小时取样一次，并采用改良的 Northern 印迹技术进行研究。

可明确检测到rRNA、mRNA和小RNA的甲基化。对野生型小鼠肝脏中的总RNA及去除rRNA后的RNA进行了代表性m6A印迹实验。若操作熟练，该技术可在四天内完成。

该技术问世后，为RNA表观遗传学领域的研究人员探索与昼夜节律和肥胖相关的人体生理影响开辟了道路。