利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本siRNA筛选实验方案的目的是研究基因沉默对癌细胞系球状体生长的影响。与传统的二维细胞培养技术相比，癌细胞球状体所呈现的条件更接近体内肿瘤的实际环境。该方法可用于对人类癌症中频繁发生改变的基因进行功能评估，更重要的是，可在更复杂的培养条件下（例如三维培养，尤其是低氧条件下）确定哪些基因可能是潜在的癌基因或肿瘤抑制基因。

该技术的主要优势在于其易于调整，研究人员可将其用于在自己偏好的细胞系中研究特定的目的基因。我们认为，该方法在现有靶向小RNA筛选技术的基础上有所发展。人们普遍认为，与全基因组筛选相比，靶向筛选能够使科学家提出更具体的问题，并获得更可靠的结果。

我们已分析了基因沉默对球状体存活率和大小的影响，但您也可以使用生物染料进行其他类型的筛选检测，例如细胞凋亡。本实验操作由本实验室的Patty Wai进行示范。首先将含有siRNA文库的96孔板在室温下解冻。

然后使用台式离心机在1,000 × g条件下离心5分钟。用多通道移液器向每块板的孔中加入10 µL含有优化转染试剂的低血清培养基。孵育15分钟，使包含siRNA的转染复合物形成。

与任何筛选流程一样，在进行全量筛选之前，应充分优化细胞系在转染条件下的成球能力。接下来，用胰蛋白酶消化待筛选的细胞，直至其从培养瓶上脱落。细胞脱落后，加入适量的细胞系特异性培养基以中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至离心管中，在台式离心机中以1,000 × g离心5分钟，以收集细胞。

弃去上清液，用适量培养基将沉淀重悬为单细胞悬液。使用自动细胞计数仪进行细胞计数。然后用冷培养基将悬液稀释至每180微升含5,000个细胞。

将细胞悬液转移至储液槽中。使用设定为180微升的多通道移液器，混匀并转移细胞悬液至含有siRNA的96孔板中。将板在预冷至4摄氏度的离心机中以1,000 × g离心10分钟，随后将板置于37摄氏度的组织培养孵箱中孵育。

此时，细胞将呈马赛克状分布于孔底。24小时后，在显微镜下观察细胞。此时，细胞应已聚集在一起，在孔的中央形成一个单一的球状体。

向每个孔中加入 100 微升完全培养基，以促进细胞生长，然后放回培养箱。培养三天后，轻轻吸出每个孔中的 100 微升培养基，并加入 100 微升新鲜培养基。在第七天，在显微镜下观察类球体，随后使用酶标仪定量分析类球体大小，以随时间定量监测类球体的生长情况。

为了定量分析球状体大小，首先打开计算机上的软件。选择96孔板，选定合适的板类型，并输入实验名称。然后，将含有球状体的96孔板插入台式微孔板成像细胞仪中。

接下来，选择“肿瘤球体”应用。选择基于图像的对焦方式，调整对焦以使类球体处于清晰对焦状态并具有最佳对比度。选择需要扫描的孔位，然后开始扫描。

接下来，确保对象掩膜准确反映球状体的大小。对于培养七天的 BT474 球状体，将“精度”调整为“高”，并将最小菌落直径设置为 200 微米。使用导出功能，以带注释的数据文件形式导出数据，用于分析鉴定对球状体面积具有统计学显著效应的 siRNA。

成像后，从每个孔中移除 100 微升培养基，并加入 100 微升发光型活力染料以测定细胞活力。将培养板孵育 15 分钟后，使用发光酶标仪扫描培养板。该方案也可经调整后用于其他癌细胞系。

非靶向对照的反向转染操作对所测试的任何细胞系的活力均无显著影响，而泛素B（Ubiquitin B）作为阳性细胞杀伤对照，其转染则显著降低了细胞活力。BT474细胞以三复孔形式反向转染了包含200个基因的人类siGENOME siRNA文库。随后观察了球状体面积及细胞活力。

识别出 z 值大于 1.7 的显著离群值。显著增加或减少球状体面积和活力的 siRNA 以蓝色标示，红色表示对照 siRNA。这组显微图像展示了 BT474 球状体在使用 E-Cadherin、非靶向对照、PIK3CA、ERBB2 或 SF3B1 siRNA 进行反向转染后第七天的代表性图像。

该直方图显示了每种 siRNA 处理在反向转染七天后对细胞活力的影响。与对照组相比，ERBB2 和 PIK3CA 的基因敲低显著降低了细胞活力。该图像表明，类球体可成功进行免疫染色，以揭示基因沉默对靶蛋白的影响。

一旦掌握该技术，每天可在多种细胞系中筛选数百个基因，从而高效鉴定出在三维培养条件下对细胞存活可能具有重要作用的新基因。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功培养适用于sRNA介导基因沉默的癌细胞球体，并能够通过对球体进行免疫组织化学染色来分析基因沉默所产生的影响。

这可以提供有价值的空间信息，有助于揭示潜在的生物学机制。