采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

该手术方法的总体目标是在保留大脑中动脉完整的情况下，稳定且可靠地诱导缺血性脑卒中。该技术有助于回答脑卒中研究领域中的一些关键问题，例如治疗手段对脑卒中严重程度的影响。该技术的主要优势在于，脑卒中诱导后，大脑中动脉仍保持通畅，可用于直接向受损半球灌注治疗药物。

将用异氟烷麻醉的小鼠放置在准备好的手术台面上，并连接鼻罩以输送混有氧气的异氟烷。确保呼吸频率维持在每秒一次至两次，且无喘息现象。此外，需确认动物对胡须刺激或足底反射无反应。

使用无菌棉签在每只眼睛上涂抹一滴眼用润滑剂，以防止在手术过程中眼睛干燥。剃除切口区域的毛发后，使用70%乙醇和基于氯己定的溶液彻底消毒手术区域。将动物置于立体显微镜下的温暖手术台面上。

接下来，使用手术剪和镊子，从胸骨上方至下颌下方沿颈部正中线做一浅层切口。用镊子仔细分离脂肪组织和结缔组织，以暴露气管。组织应自然地向两侧分开。

然后在颈部后方放置一个枕头或其它直径约0.5厘米的圆形物体，以伸展颈部并进一步暴露手术区域。使用组织牵开器或牵开钩打开切口。随后在气管左侧，小心地用镊子分离结缔组织，暴露左侧颈总动脉，同时避免损伤附近的神经和主要静脉。

接下来，将弯头镊子插入颈总动脉（CCA）下方，刺穿结缔组织，然后缓慢张开镊子以松解颈总动脉。将颈总动脉与其下方组织分离，暴露大脑中动脉和大脑外动脉的上方Y形分支。颈总动脉暴露后，在其下方穿入三段尼龙缝合线。

确保CCA没有扭曲，否则会极大地增加缝线插入的难度。然后在尽可能低的位置，使用永久结缝合底部缝线。在ICA和ECA分叉下方不远处，用可拆卸的滑结缝合顶部缝线。

接下来，使用可拆卸的滑结绑扎中间的缝线，但保持其完全张开。然后，用显微解剖弹簧剪刀在颈总动脉（CCA）下端缝线与中间缝线之间靠近下端缝线处做一个0.2毫米的切口。用镊子将MCAO缝线插入颈总动脉切口，并引导其向上端缝线方向推进。

然后轻轻收紧颈总动脉（CCA）上中间缝线的滑结，使其限制大脑中动脉阻塞（MCAO）缝线周围的血流，但又足够松弛，以允许 MCAO 缝线自由移动。现在小心地解开上方的缝线，确保 MCAO 缝线不会滑出。将 MCAO 缝线向颈内动脉（ICA）内插入数毫米，然后像之前一样用滑结重新结扎上方的缝线。

接下来，将MCAO缝线引导至闭塞部位，首先将其经ECA远端插入ICA，然后确保缝线保持在ICA内，绕过蝶腭动脉。若颈总动脉（CCA）切口处几乎没有血液反流，且银色9毫米标记位于CCA切口与ICA和ECA分叉之间，则表明插入成功。成功闭塞后，紧密结扎中段和上段缝线，然后将缝线埋入切口区域。

移除牵开器或组织钩以及垫枕后，使用蘸有无菌生理盐水的棉签清洁缝合区域。然后用尼龙缝线缝合皮肤。将小鼠置于放置在加热垫上的洁净笼子中，以防止低体温，并给予自由饮水和软质食物。

至少观察动物 5 到 10 分钟，监测其是否出现中风迹象。根据缺血再灌注实验方案，将大脑中动脉阻塞（MCAO）缝线保留 30 分钟至 120 分钟或更长时间。按照之前的方法对动物进行麻醉，并拆除伤口缝合线后，使用镊子和组织分离器重新打开切口，暴露颈总动脉（CCA）。

然后小心拆除上方的缝线，并轻轻牵拉MCAO缝线，直至硅胶包被部分位于中间结扎处。重新打上方结扎结，以防止血液流过MCAO缝线。接着小心松开中间结扎结，并将MCAO缝线从上方结扎结处拉出，同时保持其位于颈总动脉（CCA）内。

紧密结扎顶端结以阻断动脉血流。随后完全拔出MCAO缝线，并紧密结扎中间结。缝合切口，并按之前方法进行术后护理。

该示意图以蓝色显示了本视频所演示操作导致的梗阻区域。手术区域位于图的底部，由椭圆形标示，缝合位置以黑色线条表示。以下图像显示了脑切片的TTC染色结果。

该图像显示了假手术插入后的典型染色结果。此图像代表了60分钟MCAO后90分钟再灌注所导致的组织损伤情况。在60分钟MCAO后24小时再灌注时，可观察到更严重的组织损伤。

对神经元标志物 MAP2 进行免疫荧光染色，可清晰显示右侧图像中经 60 分钟阻断后又进行 23 小时再灌注所导致的神经元丢失。通过 GFAP 免疫荧光染色可观察到星形胶质增生。在右侧图像中，星形胶质细胞主要集中于缺血再灌注脑组织损伤区域的邻近部位，而在假手术对照组中则呈现出弥散性的染色模式。

在进行该操作时，重要的是要监测动物的健康状况和闭塞时间。操作完成后，可采用其他技术，如异常行为分析和免疫荧光，以进一步探讨组织损伤与修复的相关问题。