高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

本实验方案的总体目标是利用一种单一的组合式实时检测方法，鉴定出能够特异性抑制胞内细菌生长且对宿主细胞无毒性的特定小分子抑制剂。该方法有助于解答抗菌药物发现领域中的关键问题，特别是：哪些类型的化合物能够进入细胞内区室，在不损害宿主细胞的前提下杀灭病原体？

该技术的主要优势在于能够利用非破坏性、实时检测方法同时检测细菌生长和哺乳动物细胞毒性。通常，初次接触该方法的研究人员在应对该技术所提供的高通量检测能力方面会遇到困难。单次实验中检测超过一万个化合物需要一套全新的技术和设备。

除了 Lucius 之外，参与展示学术抗菌发现和转化诊断微生物学共同承诺的还有博士后研究员 KP Smith、Yoon-Suk Kang、Jennifer Tsang、Thea Brennan-Krohn，以及本科生 Kat Truelson。为准备宿主细胞，需将 J774A.1 巨噬细胞悬浮培养于 RPMI 1640 培养基中，并添加 9% 铁强化的小牛血清。

首先在组织培养瓶中传代细胞。当细胞在含有15毫升培养基的75平方厘米组织培养瓶中达到汇合状态时，用刮取法将细胞收集，并用相同类型的培养基稀释至65毫升。取15毫升重新接种回组织培养瓶中，其余50毫升转移至250毫升的细菌摇瓶中。

通过将转速设置为约每分钟120转进行通气。为保证生长一致性，在精确控制的5%二氧化碳和37摄氏度条件下培养。当细胞密度达到每毫升250万个至500万个细胞时收获细胞。

确保死细胞比例不超过25%，因为死细胞会增加细胞毒性检测中的背景噪声。使用液体处理设备分配大量巨噬细胞和细菌时，必须防止细胞在储液槽中沉降。在分配过程中每隔几分钟轻轻摇动储液槽，以避免分布不均和检测板孔间的差异。

将细胞以每孔30微升培养基中50,000个细胞的密度接种于白色组织培养处理过的384孔微孔板中。将微孔板孵育过夜，使实验当天细胞融合度达到90%。通过在新的BCYE平板上密集涂布细菌，孵育一天以获得融合生长，从而为实验制备细菌菌斑。

用培养 J774A.1 细胞所用的相同组织培养基重悬生物体。为进行巨噬细胞感染，加入待测化合物，包括筛选化合物，以及用于真核细胞裂解中细菌生长抑制的阳性和阴性对照。

储存液应以DMSO或水溶液溶解，浓度不低于500倍，以便对溶剂进行充分稀释。将发光细菌用组织培养基稀释至目标浓度为每毫升250万CFU。然后，加入适量的无毒且不能透过膜的核酸染料，使其终浓度为检测浓度的2.5倍。

向每个培养孔中加入 20 微升该混合物。最终检测体积为 50 微升，lux epron 报告系统的最终细菌浓度应为每毫升一百万 CFU，荧光蛋白报告系统则应为每毫升四百万 CFU。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳、100% 相对湿度条件下孵育一至三天，以防止蒸发边缘效应。

为避免读取检测结果时因温度相关边缘效应产生干扰，应在读取发光信号前将微孔板置于实验台面上，单层放置，盖子微开，静置约20分钟，使其达到热平衡。根据所使用的报告系统，选择适当的微孔板发光仪或荧光仪检测细菌生长或真核细胞毒性。若需在后续时间点进行实时读数，应将微孔板放回培养箱中继续培养。

按照文本方案中所述分析数据。对于剂量反应和协同作用检测实验，按先前方法在细菌中培养巨噬细胞。在巨噬细胞感染或无细胞培养之前，使用自动化液体处理系统，根据制造商方案通过自动直接添加抗菌剂稀释液，以建立组合协同作用检测中的单剂量反应。

以系列倍比稀释的方式加入具有实验意义的抗菌剂。目标是在高浓度端涵盖能够完全抑制生长的浓度，而在低浓度端包含无明显活性的浓度。此处展示的是随时间变化的细菌发光及与细胞毒性相关的荧光的代表性结果。

注意抗菌治疗与真核细胞毒性去垢剂的不同作用效果。在同一筛选孔中进行双重IC50和CC50剂量反应测定，以确定多西环素抗生素的选择性。细菌复制受到抗生素中等浓度的抑制。

然而，在高浓度下观察到细胞毒性，这与约100的选择性一致。采用相同的检测方法对米诺环素和阿奇霉素联用的二维剂量反应进行了测试。等效抑制曲线连接了胞内生长抑制程度相同的点。

此处，凹形等高线表明这两种药物具有显著的协同作用。通过数字分配机器人进行实验设置、实时读出以及高通量格式，实现了三药联合协同效应的检测。在此，观察到明显凹陷的曲面，表明米诺环素、阿奇霉素和利福平三者联用对嗜肺军团菌胞内生长具有高度协同抑制作用。

观看本视频后，您应能充分理解如何在高通量检测体系中，将荧光或发光检测读数与实时细胞毒性检测相结合。在完成该实验流程后，还可进一步采用共聚焦显微镜等其他方法，探究全细胞水平的生物学事件，这些方法同样可用于评估其抗微生物活性或全细胞细胞毒性。尽管本研究聚焦于军团菌复制的影响，但相同的技术也可应用于其他胞内病原体，如布鲁氏菌（Brucella）和分枝杆菌（microbacteria）。

我们最初构想该方案时，旨在寻找一种足够简单且可靠的检测方法，以用于超高通量筛选。请务必注意，操作细菌病原体、细胞系以及机器人设备时存在一定的固有风险，应采取适当的预防措施，例如在执行本实验程序时使用合适的个人防护装备。