激光显微切割RNA测序的实验设计：来自玉米叶片发育分析的经验

该方法的总体目标是对特定细胞或细胞区域中的转录本积累进行定量，从而能够在不同区域之间，或突变型与野生型样品的相同区域之间进行比较。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如器官区域如何被确定，或特定突变如何影响基因表达。该技术的主要优势在于，能够在极微小且精确定义的区域中对转录本积累进行定量，而这些区域通常过于微小，无法通过手工解剖分离。

在开始此操作之前，将玉米幼苗在标准条件下培养至两周龄。为了切取茎尖的侧向切片，首先在土壤线以下切除一株幼苗，然后使用剃刀从茎基部切去薄层组织，直至显现出一个被一到两片成熟叶片包围的椭圆形静止中心。

在基部上方约10毫米处再做一次切割。该10毫米的茎段包含幼叶原基中的茎尖分生组织。将此10毫米茎段翻转，使基部朝上。

沿外侧轴平行进行两次切割，获得厚度为二至三毫米的组织切片。弃去外侧两部分，保留中央切片用于固定和包埋。将组织切片浸入盛有约10毫升固定液的玻璃小瓶中，置于冰上。

所有样品解剖完成后，施加真空以去除气泡并促进固定剂渗透。保持真空状态10分钟，然后缓慢释放真空。更换固定剂，并在4°C下轻轻振荡孵育过夜。

第二天，继续按照文本方案中所述的步骤对组织进行包埋前处理。进行石蜡包埋时，将包埋模具置于组织包埋机的加热板上，用镊子将组织样本转移至包埋模具中，使切面朝下。将包埋环套在模具上方。

用融化的石蜡将每个模具注满。将模具转移至冷板，直至石蜡完全凝固。将石蜡块储存于含有硅胶的密封容器中，置于4°C条件下保存。

按照标准操作程序，使用切片机从石蜡包埋块上切取切片，并选择包含茎尖分生组织的中位切片进行贴片。将切片贴附到载玻片上时，使用无RNase或在42摄氏度载玻片加热台上烘烤过的载玻片。在每张载玻片上滴加数滴50%乙醇溶液，使其覆盖整个表面。

将切片轻轻放置在载玻片上，使其在乙醇溶液中漂浮，直至切片完全展开。接着，倾斜载玻片，用一次性移液管吸除多余的乙醇溶液。使用无绒擦拭纸吸去残留的乙醇溶液。

将载玻片在 42 摄氏度下干燥数小时或过夜。载玻片干燥后，将其储存在含有硅胶的密闭容器中，并置于 4 摄氏度环境下。在进行显微切割当天对载玻片进行脱蜡处理。

准备三个玻璃染色缸，其中两个各装入约50毫升的100%二甲苯，另一个装入约50毫升的100%乙醇。将载玻片依次浸入第一个二甲苯缸中2分钟，第二个二甲苯缸中2分钟，再放入100%乙醇中1分钟。取出后用无绒擦拭纸沥干，并在室温下晾干。

开始此操作时，将切片固定在激光显微切割显微镜的载物台上。在涉及RNase的实验中，激光显微切割成功的关键因素是使用形态学和分子标记来精确选择待切割区域。使用5倍物镜观察切片，并以茎尖分生组织顶端作为中心参考点，确定每张切片上最接近中位的五个切片位置。

接下来，使用10倍或20倍物镜确定每个切片中第七叶原基叶舌的位置。叶舌表现为叶原基近轴面突出的一个小突起。使用激光显微切割软件的绘图工具标记该位置。

选择自由绘制图标，将光标移动到适当位置，然后单击并拖动鼠标进行绘制。下一步是使用标尺和矩形绘制工具，在每个切片的叶舌上居中测量高度为100 µm的矩形区域，作为叶舌样本。使用标尺工具时，先选择标尺图标，将光标移至待测量区域的一端，然后单击并拖动以测量该区域。

屏幕上将显示标尺的长度。使用标尺工具测量以叶舌为中心的100微米片段。要绘制矩形，请选择直线绘制工具并绘制四条直线。

以相同方式，测量位于叶舌区域矩形上下方各50微米处的100微米矩形区域。这些区域将作为叶片和叶鞘样品。使用激光切割功能沿所选区域的轮廓切割组织切片，并利用弹射功能将组织矩形从载玻片上弹射至管盖内。

分别将叶舌、叶片和叶鞘样品收集到不同的离心管中。采用相同方法，从 plastochron 七期的叶原基中显微分离叶片、叶舌和叶鞘的近轴表皮组织样品。最后，向显微分离的组织中加入RNA提取缓冲液，并按照文中所述方法进行RNA提取、RNA扩增、文库构建、测序及生物信息学分析。

当分析转录本积累情况并检测叶片、叶舌和叶鞘区域的所有细胞层时，共发现2,359个差异表达基因。在近轴表皮的叶片、叶舌和叶鞘区域，共发现3,128个差异表达基因。激光显微切割、RLM、RNA测序和原位杂交分析的结果一致，这些代表性基因的分析结果如图所示。

左侧图示为所有细胞层的激光显微切割（LM），右侧图示仅为近轴表皮层的激光显微切割（LM）。图像中的箭头指示正在形成的叶舌。Ligules one 转录本在所有细胞层和表皮层 LM 中的叶舌区域均显著升高。Narrow sheath one 在所有细胞层 LM 和近轴表皮层 LM 的叶舌区域均显著上调，并特异性地积累于正在形成的叶舌顶端。

一个功能未知的基因在叶舌表皮激光显微切割样本（ligule epidermal LM）中的平均计数高于全层激光显微切割样本（all layers LM）。该转录本在表皮细胞中积累最为显著。第四个基因 Zm PIN1a 在全层细胞分析中未显示显著差异表达，但在仅表皮细胞的分析中于叶舌部位显著上调。当收集所有细胞层时，其在维管组织中的高表达可能掩盖了表皮中转录本积累的差异。

在进行该实验操作时，需要牢记：选择用于显微切割和比较的细胞区域，以及显微切割的准确性，对实验的成功至关重要。