利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

本实验的总体目标是演示如何利用开源软件和基本仪器，在自动化的多孔板工作流程中实现时间门控荧光寿命成像显微技术（FLIM）。该方法可应用于一系列固定细胞或活细胞的基于FLIM的检测，尤其适用于细胞信号转导或蛋白质相互作用的研究。

该技术的主要优势在于，荧光寿命成像（FLIM）可提供可靠的定量读数，并能在单次测量中获得相互作用分子群的比例。通过对数百个视野中的数千个细胞应用全局分析技术，我们可以利用荧光共振能量转移（FRET）读数，并能够检测到例如荧光寿命低至约20皮秒的变化。

将由我们的研究助理 Sunil Kumar 和软件开发人员 Ian Munro 与 Frederik Gorlitz 一同演示该操作流程。首先启动 MicroManager，打开 openFLIM-HCA 插件。在 FLIM 控制选项卡下，选择延迟盒校准文件，并打开校准文件。

选择针对特定延迟发生器单元和激光重复频率组合的校准文件。在文件菜单下，选择设置基础文件夹，并指定用于保存数据的文件夹。在确认所有相关参数均已正确设置后，在整个实验过程中，手动将选通式光学增强器控制箱的门宽设置为四纳秒。

为获取仪器响应函数图像数据，需手动将光束挡板放置于物镜前的滤光立方盒内，以阻止任何激光逸出，并调整光束挡板角度，尽量减少反射光返回显微镜主体。在光路控制选项卡下，设置转盘单元中的激发、二向色镜和发射滤光片，使得来自旋转尼普科夫转盘的激发光散射部分能够在不少于200毫秒的相机积分时间内成像，且系统不发生饱和。在荧光寿命成像（FLIM）控制选项卡下，对可编程快速延迟盒所覆盖的全部延迟范围，使用“查找最大值点”功能。

然后检查显示的输出轨迹，并设置粗调延迟时间，使整个仪器响应函数曲线位于快速延迟盒的扫描范围内。调节中性密度和曝光时间参数。

此外，还需进行帧累积，以确保相机在亮度时间门内不发生饱和，且有效积分时间不少于200毫秒。在FLIM控制菜单下，选择快速延迟框，并在整个延迟范围内设置25皮秒的延迟步长。接着，选择填充延迟，然后点击拍摄FLIM图像，以获取仪器响应函数图像。

等待采集完成。在光路控制菜单中，选择中性密度，并点击“阻断”以关闭激光。打开荧光寿命成像控制菜单，选择快速延迟框，通过增加增量框中的数值来减少延迟步数。

然后点击“拍摄FLIM图像”以获取背景相机图像。为获取参考染料数据，请转到XYZ控制选项卡，并在“转至孔”对话框中输入H4孔。接着，转到光路控制选项卡，选择适当的激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，使用“查找最大值点”功能，在快速延迟框的全范围内对M turquoise荧光蛋白进行成像。

然后设置适当的参数以获取参考芯片数据和相应的背景图像，方法如前所述。要从多孔板样品中获取FLIM数据，请进入高内涵筛选（HCA）序列化采集菜单。选择XYZ位置选项卡，并设置需要成像的孔以及每个孔采集的视野数量。

选择一个包含待成像样本的代表性视野，并调整相机的积分时间及中性密度滤光片，使读出相机的信号达到其动态范围的75%。在XYZ控制选项卡下，于自动对焦对话框中选择返回焦点控制，并手动将显微镜聚焦于目标细胞或结构。将自动对焦搜索范围设置为2000微米，然后按回车键。

然后点击“AF now”以启动自动对焦程序。聚焦偏移自动对焦字段中将显示一个偏移值。将此偏移值输入到AF偏移窗口中，然后连续两次点击“AF now”以重复自动对焦程序。

此时，偏移值应设置为零，表明自动聚焦系统工作正常。接下来，在FLIM控制选项卡下，选择自动门控功能，以确保延迟时间点的对数采样。将累积帧数设置为一个能够达到所需总数据采集时间的数值。

然后，在FLIM采集对话框中，单击“启动HCA序列”按钮以运行FLIM多孔板采集，并如前所示获取背景相机图像。此处展示了一个使用共表达细胞中的模型FRET系统进行的代表性FLIM FRET检测，以及各孔中典型视野下自动采集的荧光寿命图像示例。在本实验中，阴性对照孔显示出最长的寿命，而供体寿命在具有最短连接子长度的FRET构建体中表现最短。

总体而言，每个孔内所有视野的平均寿命在多孔板之间存在差异。对A1孔中所有成像细胞的供体荧光强度衰减曲线进行平均，并结合单指数衰减模型拟合及仪器响应函数，表明该拟合模型是有效的。进一步对多孔板各列的平均荧光寿命进行分析（基于逐像素单指数拟合获得），显示在FRET构建体中，随着连接子长度变短，荧光寿命降低，模拟了不同FRET效率实验的结果。

在本实验中，采用单指数衰减模型对不同抑制剂作用于蛋白质寡聚化的FRET实验的FLIM数据进行拟合。荧光寿命平板图显示了每个孔的平均寿命，该值是基于八个视野的平均结果。其中一个小规模实验每孔成像四个视野，而我们的FLIM实验总耗时约为两个半小时，包括获取仪器响应函数、参考寿命数据以及在FLIM拟合软件中完成分析的时间。

进行荧光寿命成像（FLIM）实验时，重要的是要同时采集仪器响应函数和参考染料数据及其背景图像，以确保拥有分析FLIM数据所需的全部信息。利用我们的开源软件FLIM fit，还可以将这些数据拟合到更复杂的衰减模型中，例如，可用于确定FRET群体比例。

我们的FLIM高内涵分析（HCA）技术正在帮助药物发现领域的研究人员对FRET进行可靠的测量。未来，我们希望该技术能够实现基于细胞的检测中解离常数的测定。我们希望本视频论文以及我们Wiki中的信息能够帮助其他研究人员构建自己的FLIM HCA仪器，并将其应用于FRET及其他检测方法中。

请务必注意，使用激光可能存在危险，操作此类仪器时应始终采取预防措施，例如将所有激光束封闭起来。