评估环境化学品对蜜蜂从个体到群体水平发育的影响

本实验的总体目标是评估环境中农药残留对蜂群自然状态下个体蜜蜂的影响。该方法的主要优势在于，它能够同时考察目标农药或其他污染物对个体蜜蜂以及整个蜂群的影响。本方法的可视化演示至关重要，因为蜜蜂蛹较为脆弱，操作难度较大。

本实验操作将由我实验室的博士生 Ko Chong-Yu 演示。实验前，每群蜜蜂饲喂1升50%的糖浆。每周补充一次食物储备，健康的蜂群应具有九个巢脾的蜂巢和一只正在产卵的蜂王。

首先，在蜂群中找到蜂王，并将其所在一侧的至少一个巢脾替换为一个空巢脾。然后插入蜂王隔离栅，将蜂王限制在一个包含至少一个空巢脾的四框区域内。第二天，检查巢脾上是否有新产的卵，并将带有卵的巢脾与蜂王隔离开，持续72小时。

然后移除这些框板，刷落工蜂，并准备处理巢房中的幼虫。每种处理需用透明载玻片覆盖框板上随机选取的50只一日龄幼虫。用图钉固定载玻片，再用永久性记号笔在载玻片上标记识别信息。

现在使用预热至35摄氏度的BLD，配制体积为100 mL、浓度范围为0.1至100 ppm的PPN处理液。接下来三天，对蜂群育雏区进行处理。处理幼虫时，打开蜂房盖，向每个育雏室中加入10 µL的PPN BLD溶液。

第二天使用10微升处理溶液重复处理一次，并在第三天使用20微升处理溶液再次重复处理。第三次处理后，将样本放回蜂群中继续发育。在实验设计中，每个处理组需使用不同的蜂群重复四次。第七天，检查经PPN处理的幼虫，记录各处理组的死亡率和封盖率。

在第13天，记录每个处理组的羽化率。首先，去除封盖幼虫巢房上的蜂蜡。然后用尖头镊子轻轻夹住蛹，轻柔地将其拉出。

取出蛹时，应夹住头部与胸部之间，非常轻柔地将蛹取出。在正式开展实验前，需经过多次练习，以达到至少90%的存活率。将蛹转移至24孔组织培养板中，培养板内预先铺有两层实验室用纸巾。

在转移过程中务必记录任何导致死亡的损伤。将培养皿置于34°C、相对湿度70%的条件下，直至成虫羽化。在接下来的八天内，记录羽化率。

按照之前的方法建立蜂群，使用一个健康的九框蜂群，将蜂王限制在包含至少一个空框的四框区域内。将该四框区域称为A部分，五框区域称为B部分。确保蜂王隔离板完全分隔蜂群，使蜂王无法在两个区域之间移动。这种分隔对于收集一日龄幼虫群体至关重要。

第二天，像之前一样标记一组含有新产卵的100个育雏细胞，作为第一组，将其放回A部分培养三天。两天后，将蜂王转移到B部分产卵。

第二天，将B部分的100个新产的卵标记为第二组，并将该区域放回蜂群的B部分。再过两天后，将蜂王移回A部分。随后重复此过程以建立另一组，并继续每隔三天将蜂王在A部分和B部分之间轮换，直至每隔三天分配一组，共建立九组一日龄卵。在发育的前五天内，记录每组已标记的幼虫巢室的孵化率。

发育11天后，开始记录每组中封盖的蜂蛹房数量。实验第13天，用含有10或100 ppm PPN的50%糖浆处理蜂群。将1升处理液装入饲喂盒，并连接至蜂群。

第一组为未经处理的对照组，因为这些细胞现在应已完成加帽。从第17天开始记录每组的羽化率。具体操作为：将幼虫按照之前演示的方法转移至24孔板中，随后孵育该孔板，并记录后续的羽化率。

经过49天后，应已获得所有九组的羽化数据。各个蜂巢室按所述方法用PPN BLD处理。杀虫剂对蜜蜂幼虫阶段的负面影响易于观察，且具有剂量依赖性。

这些效应包括体色黑化和翅部畸形。为模拟受环境中新烟碱类农药残留影响的蜜蜂群体，整个蜂群均被饲喂含有新烟碱类农药的糖浆。第一组为对照组，这些蜜蜂在处理前已完成成虫发育。

第二组和第三组在幼虫阶段开始受到影响，第四至第九组在卵阶段开始受到影响。经PPN处理后，孵化率、封盖率、羽化率以及畸形率均发生变化。除孵化率外，100 ppm的PPN处理效果优于10 ppm。

此外，经过处理后，许多蛹因体壁变黑或无法羽化而死亡。在100 ppm PPN处理组中，封盖的巢房被破坏，受伤的蛹被移出蜂群。一旦掌握操作技巧，整个蜂群处理程序可在约一个月内完成，每天对蛹的操作可在约两小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要定期检查蜂群的状况，并在开展实验前熟练掌握蜂蛹的操作技术。切勿忘记，由于对蜜蜂毒液过敏，操作蜜蜂可能存在风险。在进行该操作时，应始终采取佩戴防护服装等预防措施。