一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）死后细胞培养的方案

本快速尸检后细胞培养方案的总体目标是建立稳定的弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患者来源细胞系，以促进开展理解该疾病并最终开发有效疗法所必需的实验。该方法有助于回答有关弥漫性内生型桥脑胶质瘤基本生物学特性及治疗策略的关键问题，例如特定药物是否在不同患者来源的细胞系中均具有疗效。该技术的主要优势在于能够直接研究患者来源细胞的生物学行为。

该技术的应用前景可拓展至弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG）的治疗，因为它能够针对该疾病的不同遗传亚型测试多种治疗策略。尽管该方法可为DIPG研究提供重要见解，但也可应用于其他疾病，例如其他儿童高级别胶质瘤、成人胶质母细胞瘤或其他中枢神经系统肿瘤。通常，初次接触该技术的研究人员会面临困难，因为高效获取并快速处理尸检样本具有较大挑战性。

在样品制备前，将组织培养罩、剃刀片、弯头止血钳及其他非无菌工具置于紫外线下灭菌一小时，并在无菌条件下进行以下所有步骤。接着，将组织转移至一个高壁的 100 毫米 × 20 毫米细胞培养皿中。移除运输过程中残留的培养基，并加入 10 至 15 毫升冷培养基进行替换。

然后，使用弯头止血钳夹住刀片，将组织切碎，同时去除血管或脑膜。最终的组织碎片应小于1毫米。随后，将组织转移至一个洁净的50毫升锥形管中。

用额外的五毫升冷培养基清洗细胞培养皿，并将样本转移至锥形管中。根据需要重复此洗涤步骤，以转移剩余组织。使用10毫升血清移液管，轻轻吹打样本四到五次。

让较大的组织碎片沉降到管底。如有必要，将样品短暂离心一分钟。为收集解离组分，将上清液和滤液通过100微米滤膜滤入新标记为“Mechanical Dissociation”的50毫升锥形管中。

将滤膜翻转至原始的锥形管上，用培养基冲洗以回收组织碎片。随后，将机械解离组分离心五分钟。然后，弃去沉淀的机械解离组分中的上清液，并将组织重新悬浮于冷的培养基中。

如果机械解离锥形管中的组织超过5毫升，则将组织分装到其他50毫升锥形管中，确保每管组织不超过5毫升。随后，将机械解离后的组织组分置于冰上保存，直至进行蔗糖梯度离心步骤。在此操作中，将含有剩余组织碎片的锥形管离心5分钟。

随后，移除上清液并加入预热的酶消化液，使每1毫升组织加入5毫升消化液。然后，用封口膜密封锥形管管盖，并于37°C在旋转摇床上孵育反应30分钟。孵育结束后，轻轻吹打样品。

使用10毫升血清移液管将样品上下吹打6到8次，避免产生过多气泡。接着，在移液管末端安装一个1,000微升的移液枪头，再将样品进一步吹打6到8次。让任何残留的组织块沉降到管底。

然后，将上清液连同仍处于悬浮状态的细胞一起转移，并通过100微米滤膜过滤至新标记为“酶解离”的50毫升锥形管中，置于冰上保存。随后，将酶解离管离心5分钟，继续进行蔗糖梯度离心。如果样品仍悬浮在溶液中，则再次离心5分钟。

接下来，移除上清液，并将组织重悬于 20 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 中。然后用冷 HBSS 将体积补至 25 毫升。缓慢加入 25 毫升 1.8 摩尔蔗糖溶液，倒置离心管以混匀。

这将形成一个0.9摩尔的蔗糖梯度。随后，以无刹车方式离心样品10分钟。小心吸除髓鞘碎片及尽可能多的蔗糖溶液。

然后，加入 30 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 缓冲液洗涤样品，并轻轻混匀。之后，以 5 分钟离心。在此步骤中，弃去洗涤上清液。

加入5 mL ACK裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下轻轻摇动离心管1分钟。然后加入30 mL不含钙和镁的冷HBSS终止裂解反应。随后，离心5分钟。

将最终的细胞沉淀重悬于 10 至 15 毫升含生长因子的预温完全 TSM 培养基中，使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上定量活细胞密度。随后，将最终细胞悬液转移至新的 T75 培养瓶中。每隔一天补充一次生长因子以维持总体生长因子水平，并观察肿瘤细胞神经球的形成情况。

以下是样本从培养早期阶段到形成稳定培养物的不同示例。最初，接种后及早期培养物通常看起来存活的细胞数量较少。此外，早期的细胞簇通常不表现出神经球所特有的明显对比度。

然而，通过这些细胞簇的初次传代，结合细胞簇的反向过滤，可分离出能够形成球体的健康肿瘤细胞。滤液通常含有残留的碎片。这些来源于患者的样本随后可在体外培养中进行多次传代维持。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四小时内完成。在实施该步骤时，除酶解离步骤外，每个步骤均需确保样品保持低温，并尽量减少对样品的机械损伤。通过该方法处理后，可进一步开展其他研究，例如体外药物筛选或原位异种移植，以回答有关弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG）病理生物学的后续问题。

该培养技术建立后，为儿童神经肿瘤学领域的研究人员探索弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患儿的新型治疗途径奠定了基础。观看本视频后，您应能够掌握如何对脑肿瘤组织样本进行快速尸后细胞培养操作。请务必注意，操作人体组织可能存在生物安全风险，因此必须始终采取相应预防措施，例如穿戴个人防护装备并采用无菌操作技术。