分析柱状和层状结构中的树突形态

本实验方案的总体目标是分析成年果蝇（Drosophila）视叶神经元在柱状和层状结构中的树突分布模式，以表征树突形态、基于形态特征确定细胞类型，并鉴定突变体。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，包括脑神经环路的绘制以及树突连接机制的理解。该技术的主要优势在于能够完整呈现树突在三维空间中的分布特性，从而加深对树突连接逻辑与功能的理解。

本实验的目的是以两个正交的水平和冠状方向获取目标神经元的两组图像序列。采用标准技术，使用兔抗GFP抗体和标记感光细胞轴突的抗体作为一抗，对解剖得到的果蝇大脑进行染色。随后用荧光二抗标记一抗，并将大脑组织置于70%甘油和1×PBS中透明处理。

为了以水平方向封片脑组织，将经甘油透明处理的脑组织转移至载玻片中央的20微升抗荧光淬灭封片剂液滴中。然后在盖玻片的四个角上粘附少量黏土小块，以防止盖玻片压碎脑组织。接着在解剖显微镜下，将脑组织置于腹面朝上的位置。

利用脑组织背侧的凸面作为解剖标志，以确定脑样本的方位。这将提供神经元的水平切面视图。然后贴附盖玻片。

使用共聚焦显微镜（理想情况下配备 GaAsP 检测器），采用高数值孔径物镜和 2.5 倍数字放大倍率获取水平面图像序列。至少采集 180 个光学切片，图像分辨率为 512×512 像素，步进间距为 2 微米。采集完第一组图像序列后，从载玻片上移除盖玻片，并将脑组织重新放置为前部朝上的位置，以获得前额面视图。

然后使用相同的技术，对在水平视图中成像的相同神经元制作冠状面的新图像序列。务必同时记录目标神经元相对于髓质神经 Neuropal 的位置。在较低放大倍数下可以实现相同神经元的识别。

然而，如果由于组织较深而导致信号丢失，则仅需成像大脑的腹侧半部分。同时，通过检查图像堆栈来确认在采集图像过程中样品是否发生移动。图像去卷积和图像合并的具体步骤详见文本方案。

该实验步骤的目标是追踪神经突并为配准分配参考点。首先打开重组后的图像文件，然后进入编辑模式。

然后显示显示调整，并关闭红色的光感受器通道。接下来以超越模式观察图像。如果计算机配备了立体成像系统，请开启立体显示，并使用四缓冲模式来观察三维图像。

添加新的纤维，进入 surpass，然后选择纤维，点击标有“跳过自动创建，手动编辑”的选项卡。接着点击“绘制”选项卡并选择 AutoDepth。然后选择“设置”。

切换线条选项并输入适当的像素数值以获得更好的可视化效果。然后依次启用显示树突、起始点和分支点，并将渲染质量设置为100%。现在选择绘制选项卡，开始追踪神经突。首先追踪轴突，然后转向树突。

中脑转神经元的轴突和树突应易于区分。追踪完神经突后，返回设置，取消勾选起始点和分支点。然后进入超越，再进行导出。

选择对象，并将纤维保存为 Inventor 文件。下一步是分配参考点。首先，选择显示显示调整并打开两个成像通道。

然后进入“超限”模式，再进行测量。在“编辑”选项卡下，打开特定通道，本例中选择光感受器通道。现在为最上层指定参考点。

选择“surpass”，然后选择“measurement points”，并将m1层的起始位置标记为顶层。使用裁剪平面功能以辅助点的分配。点的顺序依次为：赤道、前赤道、前部、前腹侧、腹侧、后腹侧、后部、后赤道和中心。

为了找到中心感光细胞，需选择与最多树突突触相关联的细胞。接下来，使用相同的技术为R8和R7层指定参考点。在定义每组参考点后，导出其坐标。

选择统计，然后选择详细、具体的数值和位置。接着在选项卡中选择“导出统计到文件”，并将坐标保存为 CSV 文件。接下来，在电子表格编辑器中打开这三个 CSV 文件。

将27个参考点的坐标按照顶部、R8、R7的顺序复制并粘贴到一个新文件中。随后，按照文本协议进行刚体和TPS非线性配准标准化处理，以获得右侧腹面构型，用于计算树突分支和终止频率。最终，利用这些数据生成多种信息图。通过本文介绍的双视角成像方法，对包含稀疏标记的tm 20神经元的果蝇大脑在两个正交方向上进行了成像。

图像重组可提高轴向分辨率。重组后的图像分辨率优于水平视图和前视图图像的分辨率。在查阅三维模型后，采集了15至20个神经元的树突轨迹，并与2个神经元的树突轨迹进行了比较。

对这些神经元的分支和终止概率进行了分析。对于小于4微米的节段，两种类型相似。树突终止的层特异性分析显示，这两种神经元类型以不同的层特异性方式分布。

tm 2 树突在 m2 和 m5 层接收输入，而 tm 20 树突终止于 m1 至 m3 层。平面分析显示，tm 2 树突向前投射，而 tm 20 树突向后投射。

观看本视频后，您应充分了解如何获取共聚焦显微镜图像中的两项图像数据。请阅读成像文件上的研究标记，并从这些图像中提取树突特性。在执行该操作过程中，务必在共聚焦成像前对样品进行正确标记。

因为如果样品在成像过程中发生移动，成像组合将无法成功。