通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

本方案的总体目标是对诱导出现心律失常的小鼠心脏进行化学透明化处理，以便通过荧光光片显微镜对整个器官中的白细胞心肌浸润进行可视化观察。该方法有助于回答器官水平研究领域中关于假体及细胞分辨率下结构的关键问题。该技术的主要优势在于，它能够对完整器官中的炎症进行定量分析和定位。

深入揭示神经假体的详细机制。我们最初产生这一方法的想法，是在急需一种可视化工具来识别耗竭模块中心律失常的细胞学机制时。在暴露一只8至10周龄小鼠的心脏后，使用21号导管穿刺右心室。

切开主动脉以允许血液流出，随后在缓慢恒定压力下用五毫升含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。接着用五毫升4%多聚甲醛继续灌注。灌注结束后，用有齿镊轻轻夹住已固定的的心脏，将器官轻微上提，切断所有组织连接。

包括流入和流出的动脉与静脉。然后将心脏置于新鲜的4%PFA中固定4小时。为脱水组织，将心脏置于黑色5毫升聚丙烯反应管中，在避光条件下用梯度乙醇溶液系列进行孵育，并在管式旋转仪上持续缓慢旋转，以防止气泡形成。

然后，用98%的二苄基醚在恒定旋转条件下孵育过夜，以清除组织。进行光片荧光显微成像时，首先将脱水的琼脂糖块放入标准样品 holder 中，以固定样品位置。接着，将样品转移至样品 holder 上。

接下来，将样品 holder 转移至适当尺寸且装满二苄基醚的比色皿中。使用合适的激发和发射滤光片设置，以检测目标荧光信号。因此，在成像过程中，样品的正确放置和固定对于最大限度减少阴影效应至关重要。

此外，松动的样本可能会导致运动伪影，这些伪影在后期处理过程中难以消除。在获取所有图像后，打开相应的3D和4D图像处理分析软件，选择“surpass”功能。点击“file”并选择“open”，然后选中包含首个采集通道数据的文件夹，以打开图像序列。

选择编辑并添加通道，以导入相应的荧光通道采集数据。接着，点击编辑并选择图像属性，以校正 x、y 和 z 方向的体素尺寸。在新打开的窗口中调整参数。

为了调整荧光信号，首先打开编辑菜单并选择“显示显示调整”。新窗口将显示所有打开的通道。要将自发荧光通道更改为灰度，请选择自发荧光通道，选择白色显示样式，然后单击“确定”。

然后，通过移除网格来调整视图。接着，放大图像并取消选择一个通道。然后，调节黑电平值，以排除不代表样本结构、信号强度和对比度的任何非必要背景信号。

根据校正后的自发荧光通道信号，调整抗体信号通道。设置通道模式，触发将抗体信号的可视化显示为热图颜色查找表。然后选择混合模式，以详细显示组织结构。

在导出3D场景之前，若要对器官进行虚拟剖开，请在对象列表中选择裁剪平面图标。图像视图中将出现一个黄色框架和一个白色纺锤形操作手柄。使用鼠标旋转纺锤较细一端，以改变裁剪平面的方向，并移动纺锤较粗的中间部分，以选择所需的裁剪深度。

然后，取消选中相应的复选框以隐藏帧和操作器，并创建所需的快照。采集由两个荧光通道信号组成的完整图像序列，可生成人工三维渲染图像，其中白细胞分布以热图形式显示。经白喉毒素处理动物心脏中强烈炎症区域可通过其红白色外观进行识别。

尤其在心脏传导系统的区域，如房室束和浦肯野纤维中。相比之下，经对照PBS处理的动物心脏则未表现出这种炎症模式。一旦掌握该技术，即可在四到五天内完成从器官获取到计算机辅助三维重建的数字化分析。

该技术问世后，为月经学领域的研究人员探索整个小鼠器官中的细胞分布模式开辟了道路。这可能有助于分析和治疗多种病理生理疾病模型。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备用于荧光光片显微镜成像的小鼠完整器官，以及如何生成和处理三维图像数据堆栈。