使用整体免疫组织化学方法研究胆道系统的神经支配 Suncus murinus

本实验的总体目标是采用整体免疫组织化学染色法，以可视化展示麝鼩（Suncus murinus）胆道系统内的神经分布。该方法可用于分析多种物种内脏器官的神经分布，尤其适用于那些用常规方法难以评估的不规则或小型器官。该技术的主要优点在于操作简便。

该方法无需复杂的操作步骤，且成功率较高。与我一同演示该操作的是来自我实验室的研究生戴一丹（Yidan Dai）和研究员易双琴（Shuang-Qin Yi）。首先在通风橱中用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）和4%多聚甲醛对动物进行灌注冲洗。

然后通过灌注导管向腹主动脉注入2至3毫升白色氯丁橡胶乳胶，以标记血管系统。当所有目标组织均被标记后，取出腹腔器官及其相关的神经和血管。接着向胆囊内注入约0.1毫升蓝色氯丁橡胶乳胶，以标记胆道系统，并将组织在4°C条件下用4%多聚甲醛固定过夜，用于全组织免疫染色。

次日早晨，将样品转移至玻璃小瓶中，在旋转摇床（nutator）上用蒸馏水于室温下洗涤四次，每次一小时。最后一次洗涤后，将组织在新配制的1%过碘酸（orthoperiodic acid）中室温孵育20分钟，以抑制内源性过氧化物酶反应。随后，将样品在蒸馏水中室温洗涤10分钟，接着在37摄氏度恒温水浴中，以温和振荡的方式，在新配制的0.004%帕皮隆（papillon）溶液中孵育两小时。

孵育结束后，用蒸馏水冲洗样本 50 至 60 分钟。然后将组织在 4% 多聚甲醛中于 4 摄氏度下保存过夜。次日早晨，按上述方法用蒸馏水清洗样本，随后在新配制的 papillon 溶液中再进行两小时的孵育。

用蒸馏水再清洗样品50至60分钟，随后在4%多聚甲醛中固定过夜。第三天早晨，用蒸馏水将组织清洗四次，然后依次浸入三个浓度递增的蔗糖溶液中，每次孵育30分钟。接着将样品在-20摄氏度下冷冻30至60分钟，之后在室温下完全解冻。

经过第三次冻融循环后，将样本转移至含2% Triton X-100的溶液中，在4°C条件下孵育过夜。次日早晨，将样本转入含有目标一抗的容器中，在4°C条件下于摇床上轻柔振荡孵育三至六天，具体时间根据样本大小而定。完成适当的标记周期后，用PBS在室温下洗涤四次，每次一小时，以去除未结合的一抗，随后在4°C条件下加入相应的二抗，轻柔振荡孵育三天以标记样本。

在二抗孵育结束后，用 PBS 洗涤样本四次。然后将组织置于含有 10 微升 30% 过氧化氢的 100 毫升新鲜配制的 0.002% DAB 显色液中，在 4°C 下轻轻振荡孵育 16 至 72 小时。当达到最佳染色强度时，将样本转移至含 0.04% 叠氮化钠的 PBS 溶液中，以终止显色反应。

然后将样本小心浸入含有新鲜 PBS 的 10 厘米培养皿中，并使用安装在体视显微镜上的相机拍摄组织的整体图像。除了可视化肝外胆道的神经支配外，使用针对神经丝蛋白阳性神经纤维的抗体标记还可明确识别迷走神经沿食管走行并延伸至胃部的分布路径及其分布密度。使用白色氯丁橡胶乳胶标记胆囊血管，可使胆囊壁内神经纤维在周围组织中呈现高对比度的细密纤维化结构，且胆囊颈部的神经支配密度高于胆囊底部。

在上段胆管中，可观察到两种类型的神经束：一种是细小的神经束，形成不规则且致密的神经网络，黏附于胆道表面并深入其内；另一种是较粗的神经束，沿胆道表面平行分布。使用蓝色氯丁橡胶乳胶标记胆总管，白色氯丁橡胶乳胶标记血管，可清晰显示胆总管末端及十二指肠乳头区域的细小神经纤维。在进行该操作前，务必规划好每项实验的时间安排，因整个过程需要两到三周才能完成。

为避免在更换溶液时损坏标本，务必倾倒溶液，而不要用镊子夹取标本。观看本视频后，您应能够将此技术应用于各种内脏器官中多种神经的标记。