基因工程概述

基因工程是指有目的地改变生物体 DNA 的技术。该领域的进步使科学家能够为生物医学研究和农业用途生成基因改造的细胞和生物体。然而，将基因技术应用于人类治疗——即所谓的基因治疗——目前仍处于研究阶段。

在本视频中，我们将讨论基因工程发展史中的一些重要发现、当前研究的主要问题、改变生物体基因组的重要工具，以及这些技术的若干应用。

让我们首先回顾一下基因工程的发展历史。

科学家直接操控基因的能力取决于确定遗传物质的本质。1928年，Frederick Griffith 发现，将热灭活的致病菌与活的非致病菌混合后注射到小鼠体内，会导致疾病发生。据此，他提出了“转化因子”的假说，认为存在某种物质可从死亡细菌转移到活细菌中并赋予其致病性。

1944年，Oswald Avery、Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 确定这种转化因子就是细菌的DNA。这一结论在1952年进一步得到验证：Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用放射性标记的噬菌体证明，在感染细菌细胞的过程中，进入宿主的是病毒的DNA而非蛋白质。

同样在1952年，Joshua Lederberg 提出质粒的存在——即能够在细菌之间传递的小型环状DNA片段。与此同时，他还描述了转导现象，即病毒作为载体将DNA在细胞间传递。

大约从1970年开始，Hamilton Smith 等研究人员陆续发现了一些基因工程的实用“工具”，例如限制性内切酶，这类酶可在特定DNA序列处进行“切割”。利用这些工具，Paul Berg 于1972年通过连接两种不同病毒的DNA，构建出首个“重组”DNA分子；与此同时，Stanley Cohen 和 Herbert Boyer 将一个抗生素抗性基因插入质粒，并将该构建体转化进大肠杆菌 E. coli 中，从而创造出首个重组生物体。

1973年，Rudolf Jaenisch 创建了首个转基因多细胞生物——携带SV40病毒DNA的小鼠；然而直到1981年，多个实验室才成功培育出能够将插入基因遗传给后代的第一批转基因小鼠。在1980年代中期，Mario Capecchi 和 Oliver Smithies 首次证实同源重组可用于特异性靶向基因，并于1989年利用该方法成功构建出首个基因敲除小鼠，即某个基因功能被完全失活的小鼠模型。

接下来，让我们探讨基因工程中的一些关键问题。

一个重要的研究领域是确定修饰生物体基因组的最佳方法。需要考虑多个因素，包括修饰过程的效率，以及是否需要将修饰靶向特定基因，以尽量减少对细胞DNA产生非预期改变的风险。

为了修饰宿主细胞的基因组，必须成功将人工构建的用于实现该修饰的DNA序列——即“基因构建体”——递送至该细胞内。该领域的研究旨在提高递送效率的同时限制细胞毒性。在生物体水平上，研究人员致力于改造载体（如逆转录病毒颗粒或纳米颗粒），以改善基因构建体向靶细胞群体的递送效果。

最后，人们高度关注基因工程是否能成功应用于农业或治疗领域。这些技术已被用于开发强大的研究工具，例如基因被删除或“敲除”的小鼠，或向作物中插入简单的单个性状（如抗除草剂性状）。然而，对于在逆境条件下培育优良作物等复杂问题，可能需要同时修饰多个代谢通路。此外，开发用于治疗遗传性疾病的基因疗法，需要将基因构建体安全有效地递送至人体细胞，这仍然是一个具有挑战性的任务。

现在让我们来看看研究人员所使用的基因工程工具和技术。

构建遗传载体的经典方法是基于限制性内切酶的克隆技术，即通过限制性内切酶切割DNA片段，再利用DNA连接酶将这些片段按特定顺序重新连接，从而构建新的质粒。较新的技术包括重组工程（recombineering），该技术利用同源重组来分离和交换DNA片段，无需依赖限制性内切酶的识别位点。

DNA可通过多种方法导入细胞。转化（transformation）或转染（transfection）分别指将裸露的DNA导入细菌或真核细胞的过程。二价阳离子（如钙离子）可增加细胞膜的通透性，从而提高外源DNA分子的摄取效率。电穿孔（electroporation）则利用电场实现相同目的，而包裹DNA的脂质纳米颗粒可通过与细胞膜融合并释放其携带的DNA。转导（transduction）是指利用病毒载体（如慢病毒）将DNA转入细胞。

将遗传载体导入多细胞生物时需要考虑更多因素。当存在多种细胞类型时，靶向性载体（如病毒或纳米颗粒）可提高DNA递送的细胞特异性。在植物中，研究人员利用农杆菌（agrobacterium）——一种能够将DNA转移至植物细胞的植物病原菌——作为基因递送工具。“基因枪法”（biolistics）则是指利用“基因枪”将包裹有DNA的金微粒射入细胞。

最后，为了实现长期效应，导入的DNA载体需要对宿主基因组造成永久性改变。这可通过导入的DNA载体随机整合到宿主基因组中实现，若在载体上添加转座酶（transposases）识别位点，则可增强整合效率。另一方面，通过同源重组进行基因靶向的技术可实现DNA在基因组特定位点的整合。近年来，基因组编辑技术取得重要进展，该技术利用定制设计的核酸酶在特定基因位点产生双链断裂，从而显著提高基因靶向的效率。

现在，让我们来看看基因工程技术在当今的应用。

真核生物的细胞功能被区隔在不同的细胞器中，将转基因蛋白的表达靶向特定区室可能实现更特异的生物学效应。在本实验中，研究人员利用Gibson组装技术构建了一个带有GFP标签的报告基因载体，该技术通过多个PCR产物之间的同源重叠区域，无需限制性内切酶即可生成完整的载体。随后采用基因枪转染法将这些载体导入植物细胞，研究人员成功实现了GFP在叶绿体中的靶向表达。

癌细胞通常会过度表达表面受体，研究人员可利用基因治疗手段靶向这些受体。在此研究中，科学家在小鼠体内建立了人膀胱癌模型，随后将腺病毒载体局部递送至膀胱癌细胞。通过观察癌细胞中荧光素酶的表达，证实了报告基因的成功递送。

最后，在目标生物体中构建完整生物合成途径的研究也取得了进展。在此项研究中，研究人员通过PCR从红霉素的原始宿主菌Saccharopolyspora erythraea中分离出该抗生素生物合成途径中的各个基因，并将其组合成类似操纵子的结构，使一系列基因受同一调控元件控制，以实现最佳表达。随后将这些载体转化至E. coli中，重建该合成途径，最终对异源表达产生的产物进行纯化并检测其功能。

您刚刚观看了 JoVE 关于基因工程的概述视频。在本视频中，我们讨论了基因工程的发展历史，探讨了该领域的主要科学问题和常用工具，并展示了基因工程应用的若干实例。一如既往，感谢您的观看！