从附睾分离的原代上皮细胞的全细胞膜片钳记录

本实验的总体目标是从大鼠附睾中分离上皮细胞，并利用全细胞膜片钳技术测定这些主要为解离状态的细胞的电学特性。该方法有助于回答生殖生物学领域中的关键问题，例如附睾的功能，而附睾在精子成熟及父源性状遗传中具有重要作用。该技术使研究者能够表征分离的附睾上皮细胞的电生理特性，从而揭示这些细胞尚未明确的生理功能。

本实验操作将由我实验室的研究生 Bao Li Zhang 演示。开始操作前，将解剖工具浸入70%乙醇中进行消毒，然后使其自然晾干。

接下来，配制完全IMDM培养基。随后，在无菌条件下将其分装为50 ml等份，用Parafilm封口，并于4摄氏度保存。之后，通过将I型胶原酶和II型胶原酶溶解于RPMI培养基中，配制胶原酶消化液，使每种胶原酶在溶液中的浓度均为1毫克/毫升。

将溶液通过0.22微米滤膜过滤。然后标记为胶原酶溶液，并在室温下保存至使用。接着，根据酶的重量调整酶溶液的体积。

获取单只大鼠两侧尾部附睾所需的最小体积为两毫升。为分离大鼠尾部附睾，可通过腹腔注射戊巴比妥钠或使用异氟烷麻醉舱使动物失去反应，直至尾部夹捏刺激无反应，随后实施颈椎脱位处死动物。之后，用70%乙醇擦拭下腹部进行消毒。

轻轻将两个睾丸推至下腹部，然后在阴囊附近切开下腹部。随后去除附睾脂肪，并解剖出所有生殖器官。之后，将其转移至含有RPMI的培养皿中。

在洁净且气流受控的工作站中，从结缔组织、脂肪组织和附睾囊中分离出尾部附睾。将一个附睾与0.2毫升胶原酶溶液放入1.5毫升离心管中。为了从尾部附睾中解离出单个细胞，用精细剪刀在胶原酶溶液中剪碎附睾组织，直至组织成为糊状液体。

然后，用试管中剩余的酶溶液轻轻冲洗剪刀。接着，将试管置于金属恒温混匀仪中，在37摄氏度下振荡30分钟，转速为1,000 rpm。随后，将酶与组织的混合物在室温下离心3分钟。

随后，将含有大部分精子的黏性上清液倾出。接着，用一毫升完全 IMDM 重悬沉淀，以终止所有酶活性。然后，将细胞悬液转移至含有 49 毫升 RPMI 的 50 毫升离心管中。

将细胞混合物离心并弃去上清液。用一毫升完全IMDM重悬沉淀，轻轻吹打至少五分钟，以使单个细胞从经酶处理的附睾组织混合物中解离。在无菌条件下将上皮细胞与其他细胞分离，并将细胞悬液接种于含有完全IMDM的10厘米培养皿中，在32摄氏度的培养箱中培养至少八小时或过夜。

第二天早上，将盖玻片浸入100%酒精中进行灭菌处理。待其自然晾干后，再将其浸入少量培养基中。随后，将盖玻片放入6厘米的培养皿中，或置于24孔板的单个孔内。

现在，轻柔地从培养皿中收集细胞悬液，以获取已解离的上皮细胞，该悬液主要由上皮细胞组成。在室温下以30 × g离心5分钟，然后弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于2 mL完全IMDM培养基中。

将收获的细胞悬液0.2毫升接种到每张无菌盖玻片的中心。让细胞悬液在液滴中静置至少10分钟，使细胞初步贴附于玻璃盖玻片上。随后，小心地在6厘米培养皿边缘加入1毫升完全IMDM培养基，或向24孔板的每个孔中加入0.3毫升完全IMDM培养基，注意不要扰动细胞。

将分离的单细胞置于盖玻片上，在32摄氏度的培养箱中孵育，直至进行膜片钳实验。在膜片钳实验当天，将一份细胞内液置于冰上解冻，并在实验过程中保持低温，以防止降解。随后，将培养在玻璃盖玻片上的上皮细胞转移至含有标准PSS的记录室中，室温下进行记录。

在进行任何膜片钳实验之前，使用移液管至少更换两次灌流PSS溶液。为形成全细胞记录模式，将移液管以显微操作器的最高速度浸入浴液中。在连接至数码相机的屏幕上找到移液管尖端的位置。

然后，将显微操作仪的速度调至中高模式。通过计算机控制的放大器产生的电压阶跃，使用数据采集界面命令快速检测微量移液器的电阻。如果电阻显著超出此范围，则更换新的微量移液器。

使用软件指挥界面中的移液管偏移命令，将移液管与浴液之间的液接电位设为零。通过膜测试监测电阻。如果电阻大于500兆欧但小于1吉欧，施加负电位以帮助形成吉欧封接。

在此期间，补偿微移液管的瞬时电容电流。此时，从0毫伏的保持电位施加一个10毫伏的超极化脉冲，以测定封接电阻。在成功形成全细胞构型后，立即从–60毫伏的保持电位施加一个10毫伏的超极化脉冲。

将电压模式切换至零电流模式，进行10秒无间断记录，以测量细胞的静息膜电位。随后，迅速切换回电压模式并保持在此模式。根据预设的实验方案施加电压程序，并记录电流反应。

以下是大鼠附睾尾部分离的上皮细胞在进行膜片钳实验前，培养过夜后重新收获前后的细胞示例。该图显示了使用脉冲刺激方案记录的单个附睾上皮细胞的典型全细胞电流。虚线表示零电流水平。

以下是所指示时间点测得的电流反应的电压-电流关系。这些是用含有ATP或不含ATP的移液管溶液透析主细胞后，其静息膜电位的代表性记录曲线。该柱状图显示，添加ATP与不添加ATP组的初始静息膜电位之间无显著差异。

条形图中的括号内数字表示来自至少三只动物的检测细胞数量。此外，还展示了封接电阻与所有细胞或仅主细胞的输入电阻和静息电位之间的相关性分析，静息电位是在全细胞记录建立后立即在零电流钳制下测得，电流幅值则是在从保持电位超极化至负100毫伏的步骤中测得。一旦掌握，若操作得当，该技术可在九小时内完成。

在进行该操作步骤时，重要的是要记住在细胞分离过程中立即停止酶消化。否则，过度消化可能导致难以形成吉欧姆封接，从而导致膜片钳实验失败。为保持培养细胞的健康状态，需将酶解后的细胞混合液在30 G的低速条件下离心2至3分钟，随后弃去含有大部分精子细胞的黏性上清液。

通过这些操作步骤，还可以进一步开展其他方法，例如活细胞成像和单细胞培养技术，以回答更多科学问题，比如在受控条件下， naive 上皮细胞的静息膜电位是否可能调控其细胞外行为。该技术为生殖生物学领域的研究人员探索附睾上皮细胞的电生理特性提供了途径，有助于阐明精子成熟过程以及父源获得性状遗传的调控机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从大鼠附睾中分离上皮细胞，以及如何利用全细胞膜片钳技术测定这些细胞的电学特性。