使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

以下视频详细介绍了利用 C-Brick 标准，通过 CRISPR 相关蛋白 Cpf1 组装 DNA 片段的方法。该方法可进一步推动合成生物学领域中 DNA 组装技术的发展，例如促进复杂遗传回路的构建。

该方法的主要优势在于其序列无关性，能够实现DNA片段的迭代组装。我们最初产生这一方法的设想，是源于观察到Cpf1由单链siRNA引导，并将催化性DNA逐级堆叠，从而生成DKNs。

进行该实验操作的是我实验室的研究生 Shi-Yuan Li。为修复 crRNA 模板，将各条寡核苷酸用无 RNase 的水重悬，配制成 10 微摩尔浓度。向一个 0.2 毫升 PCR 管中加入上链寡核苷酸、下链寡核苷酸以及 10 倍退火缓冲液，具体用量详见随附文件。

确保总体积为 50 微升。此表格显示了六种不同的下游引物寡核苷酸，每种均应分别与上游引物 T7-F 配对。小写字母代表将被转录为 crRNA 指导序列的序列。

将PCR管放入热循环仪中。运行退火程序：首先在95摄氏度下变性5分钟，然后以每分钟降低1摄氏度的速率从95摄氏度降温至20摄氏度。退火完成后，立即进行转录反应，将退火产物与无RNase的水、T7转录缓冲液、NTP混合物、重组RNase抑制剂以及T7 RNA聚合酶在1.5毫升微量离心管中混合。

将反应物置于37摄氏度水浴中孵育过夜。次日，使用RNA纯化与浓缩试剂盒纯化转录的RNA。使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量。

然后，将RNA稀释至10微摩尔的浓度。如果样品未立即使用，请将其储存在-80摄氏度。C-Brick元件的构建可通过多种方法实现。

在本段视频中，将使用无缝克隆方法组装三种色蛋白盒：cjBlue、eforRed 和 amilGFP。首先设计并订购用于扩增这些色蛋白盒的寡核苷酸引物。当寡核苷酸到货后，用超纯水将其重悬至 10 微摩尔的浓度。

接下来，设置PCR反应时，将0.2毫升PCR管置于冰上。依次加入超纯水、2×PCR缓冲液、dNTPs、正向和反向引物、色素蛋白模板以及高保真DNA聚合酶。将PCR管直接放入热循环仪中，并运行程序。

立即使用样本，或在 -20 摄氏度下冷冻保存。扩增后，使用试剂盒纯化 PCR 产物。接下来，为用 BamH1 消化 C-Brick 标准载体，向离心管中加入超纯水、质粒、10x 缓冲液和 BamH1。

在37摄氏度水浴中孵育最多两小时。使用凝胶回收试剂盒纯化线性化载体。回收后，在1.5毫升微量离心管中将线性化载体、PCR产物、5倍无缝克隆缓冲液以及无缝克隆试剂盒中的无缝克隆酶混合。

确保总体积为10 µL。将样本置于37°C水浴中30分钟。孵育结束后，立即使用样本，或在冰上冷冻后于20°C保存。

向90微升的大肠杆菌DH10B中加入10微升的构建质粒，进行化学转化。随后将转化后的细胞涂布于LB平板上，在37摄氏度下培养。

第二天，挑选多个克隆接种于5 mL液体LB培养管中，于37摄氏度、220 rpm条件下在摇床中过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，随后通过Sanger测序鉴定正确的克隆。

需知C-Brick路径的构建也可通过反应性PCI应用实现，或通过在T4 DNA连接酶介导的连接反应中立即进行限制性消化来完成。接下来，为用Cpf1消化C-Brick载体，取无RNase的水、10× Cpf1缓冲液、质粒、重组RNase抑制剂和Cpf1，在1.5毫升微量离心管中混合。为将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA T2，并将反应管置于37 °C水浴中孵育30分钟。

然后，将离心管保持在水浴中，加入1 µL crRNA T1和1 µL Cpf1，再孵育30分钟。先加入crRNA T2，因为两个识别位点在载体DNA上距离较近，Cpf1在T1位点的结合可能会影响T2位点的结合。

此外，如果 T2' 位点替换了 T2 位点，那么当先加入 crRNA T1 时，T2' 位点将会被破坏。加入一微升热敏感碱性磷酸酶，并将反应管置于 37 摄氏度水浴中再孵育一小时。进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化载体。

立即使用样本，或在 -20 摄氏度下冷冻保存。为了用 Cpf1 消化目的 DNA 片段，将无 RNase 水、10× Cpf1 缓冲液、质粒、重组 RNase 抑制剂和 Cpf1 混合于一个 1.5 毫升微量离心管中。为了将外源 DNA 片段插入 T1 和 T2 位点，向管中加入 1 微升 crRNA T1 和 1 微升 crRNA T3，并在 37 摄氏度水浴中孵育 2 小时。

孵育结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化片段。样品可立即使用，或冷冻并保存在 -20 摄氏度。接下来，将外源 DNA 片段连接至 C-Brick 载体中，需在 1.5 毫升微量离心管中混合线性化载体与 DNA 片段。

加入10倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶。然后在22摄氏度下孵育两小时。样品应立即使用，或在20摄氏度下冷冻保存。

取10微升连接产物加入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，进行化学转化。然后将转化后的大肠杆菌涂布于LB平板上，在37摄氏度下培养。次日，挑取多个克隆加入5毫升液体LB培养管中，在220 rpm、37摄氏度条件下振荡培养过夜。

使用质粒提取试剂盒提取质粒。然后通过Sanger测序鉴定正确的克隆。进行新一轮的C-Brick组装。

利用该样品，所谓的裂解克隆可作为新的C-Brick载体或DNA片段用于进一步的C-Brick迭代组装。本视频中所述，已将三种色素蛋白盒（cjBlue、eforRed和amilGFP）进行组装。这三种色素蛋白在平板培养的大肠杆菌中得到表达。

第四块平板显示了不含色素蛋白的阴性对照细菌。随后，两个颜色表达盒进一步与C-Brick标准元件组装，以产生更多颜色。三种色素蛋白及三种组装的双色素蛋白在大肠杆菌中表达，菌株培养于液体LB培养基中。

从一到六，所表达的构建体分别为 eforRed、一、amilGFP、二、cjBlue、三、amilGFP 加 eforRed、四、eforRed 加 cjBlue、五，以及 amilGFP 加 cjBlue、六。单个培养皿上或单个微量离心管中的彩色细菌均培养自一个经序列验证的克隆。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一周内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记所有材料都应保持无RNase，以用于siRNA制备和Cpf1清除。我仍然推荐这一策略，它已帮助合成生物学领域的研究人员构建出代谢通路的遗传展示体系。观看本视频后，您应能充分理解如何使用C-Brick标准组装DNA通路。