骨髓来源祖细胞的缺氧预处理作为生成成熟施万细胞的来源

该细胞培养技术的总体目标是富集骨髓神经前体细胞，以促进其分化为功能性的施万细胞。该方法解决了干细胞与再生医学领域的一个关键问题：如何利用有限的神经前体细胞来源生成胶质细胞，以协助创伤后轴突再生和再髓鞘化。该技术的一个优势在于采用高效的培养条件，促进从骨髓基质细胞中扩增神经细胞，从而用于自体细胞治疗。

培养两天后，移除75%的用过的培养基和非贴壁细胞，并用三次10毫米PBS洗涤贴壁细胞。第三次洗涤后，将PBS替换为10毫升骨髓基质细胞（marrow stomal cells，MSC）生长培养基，并将培养物放回培养箱。可见的克隆应在第6至7天出现。

第10天，用新鲜的PBS洗涤培养物，加入1.5毫升重组酶消化细胞解离试剂使细胞脱离。在37摄氏度孵育5分钟后，加入3毫升MSC生长培养基以中和反应，并通过离心收集脱离的细胞。将细胞沉淀重悬于5毫升新鲜MSC生长培养基中，按每平方厘米4×10⁴个细胞的密度，接种至新的10厘米组织培养皿中。

传代后两天内，细胞应达到80%至90%的融合度。进行缺氧预处理时，首先松开环形夹，并用70%乙醇清洁暴露的部分。随后将缺氧培养室拆解为各个组件，放入超净工作台中，在紫外灯下消毒15分钟。

接下来，用 10 毫升 PBS 洗涤一个 80% 至 90% 汇合度的 MSC 培养物（方法如前所述），并用添加了 25 毫摩尔 HEPES 的新鲜 MSC 生长培养基处理培养物。将处理后的培养物放入重新组装的低氧培养室中，并拧紧环形夹。密封培养室的连接端口，确保无气体泄漏，并以每分钟 10 升的流速向室内通入含 99% 氮气和 1% 氧气的混合气体。

五分钟后，将培养室放入细胞培养箱中孵育16小时。次日早晨，按照前述方法消化并脱离细胞，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于神经前体细胞培养基中，以每平方厘米6×10³个细胞的密度接种至低吸附6孔板中，在37°C、5%CO₂条件下培养12天。

到第6至7天应观察到大量不贴壁的细胞球。到第10至12天，在低氧条件培养的细胞中出现的神经球数量多于常氧条件下的培养。在第12天，使用10毫升移液管将神经球转移至15毫升锥形管中，并通过离心收集神经球。

将神经球重悬于DMEM/F12培养基中，每平方厘米接种5至10个神经球至多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的6孔板中，每孔加入1.5毫升胶质诱导培养基。将球状细胞培养物维持至少7天，每3天更换一次培养基。为收获背根神经节，将第一个胚胎转移至直径10厘米的培养皿中，置于解剖显微镜下，腹面朝下，加入室温的PBS，然后沿脊髓两侧插入显微解剖镊。

使用钝性分离法，用镊子将脊髓与周围软组织分离，并沿颈部切口和尾部残端切除脊髓。清除游离脊髓上的残留软组织，直至仅剩脊髓、神经根及附着的背根神经节。将各个背根神经节从其相连的神经根上分离下来。

然后，使用配备1毫升移液枪头的移液器，将最多100个背根神经节转移至含有PBS的1.5毫升微量离心管中。通过离心收集神经节，并将沉淀重悬于每管200微升的重组酶消化细胞解离试剂中。在37摄氏度孵育10分钟后，再次离心背根神经节，并使用200微升移液枪头在背根神经节神经元维持培养基中轻轻吹打重悬沉淀。

将背根神经节细胞以每平方厘米5×10³个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入1.5毫升背根神经节神经元维持培养基，孔板预先用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被。在37°C、5%CO2条件下培养两天后，洗涤细胞，并将神经元细胞培养物转移至新鲜的背根神经节神经元纯化培养基中，继续在培养箱中培养两天。经过三至四次维持和纯化循环后，背根神经节细胞培养物应呈神经元标志物Tuj-1阳性，胶质细胞标志物S100β阴性。

在施万细胞样细胞培养的第7天，用PBS冲洗细胞，随后每孔加入0.5毫升重组酶消化细胞解离试剂，在37摄氏度下作用5分钟进行解离。将细胞沉淀重悬于共培养培养基中，并将施万细胞样细胞以每平方厘米1×10³个细胞的密度接种至纯化的背根神经节神经元培养物上，在37摄氏度和5%CO₂条件下共培养14天。健康的间充质干细胞呈现锥形形态，而经过高代次传代后失去多向分化潜能的间充质干细胞则呈现四边形外观。

扩增后的MSC集落应表现出MSC标志物的表达、造血干细胞标志物的缺失，以及向成脂、成骨和成软骨细胞系分化的潜能。经过低氧预处理的健康MSC培养物，其生成的神经球在数量和尺寸上均更大。背根神经节神经元网络的纯度可通过神经元标志物Tuj-1的表达以及施万细胞标志物S100的同步缺失来确认。

与背根神经节神经元共培养14天后，类施万细胞获得成熟且命运已定的施万细胞的特征和功能特性。只要掌握该技术，若细胞扩增操作得当，可在10天内使人或大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的神经前体细胞亚群得到扩增。在进行该操作时，重要的是需确认BMSC样本中含有巢蛋白（nestin）阳性神经前体细胞，并且所有CD45阳性的造血前体细胞均已清除。

观看本视频后，您应能够充分理解如何获取骨髓间充质干细胞（BMSCs），如何富集其中的神经前体细胞亚群，以及如何将神经前体细胞定向诱导分化为命运已确定的施万细胞，用于促进创伤后轴突再生和再髓鞘化。通过该实验流程，可获得具有髓鞘形成能力的胶质细胞（如成熟的施万细胞），进而用于周围神经系统和中枢神经系统脱髓鞘损伤及相关疾病治疗策略的开发。