无创采集黏膜衬层液用于定量分析 体内 上呼吸道免疫介质水平
2017年8月7日
本方案描述了一种非侵入性技术，用于采集上呼吸道未受扰动的黏膜衬液。该技术可用于对黏膜衬液中的成分进行定量分析。 体内 各种年龄受试者体内蛋白质介质（如细胞因子和趋化因子）的水平。
该黏膜衬液采样方法的总体目标是在无需刺激操作的情况下研究呼吸道局部的免疫特征。该方法可使您研究儿童呼吸系统疾病领域中的关键问题，例如感染、哮喘和过敏。该方法的优势在于，能够在体内直接检测未受刺激的呼吸道黏膜中极低水平的免疫介质。
该操作程序将由 Dr.Wolsk 演示。对于新生儿样本采集，首先从纤维状羟基化聚酯滤纸片上裁剪至少两条 3 × 15 毫米的条带。接着，将新生儿置于床上，并记录任何呼吸道感染症状。
然后，使用镊子将一片滤纸插入婴儿双侧下鼻甲前部约一厘米处，并根据需要给予新生儿蔗糖水以缓解不适。记录采样期间是否出现打喷嚏、持续哭闹或鼻出血等情况。滤纸吸收两分钟后，立即将其转移至已标记的试管中，并于负80摄氏度条件下立即保存。
本实验操作将由我实验室的技术员 Lisbeth Rosholm 进行示范。进行气道免疫介质定量时，从零下 80 摄氏度的储存环境中取出最多 10 个样本，置于冰上，并记录其编号。待样本完全解冻后，将每位受试者的两张滤纸分别浸入 150 µL 新鲜配制的缓冲液中（每张滤纸 150 µL），缓冲液需按每 25 mL 缓冲液母液加入一片完整的蛋白酶抑制剂片剂进行补充。
将样本转移至摇板机，在400 rpm条件下振荡5分钟。将缓冲液和滤纸转移至各纤维素乙酸酯滤管的杯中。离心样本，以收集滤过的鼻腔提取物于微量离心管底部。
然后，移除收集杯并将试管置于冰上。接着，将150 µL鼻腔提取物等分试样转移至低蛋白结合储存板的各个孔中，并将储存板保存在-80 °C直至分析。随后，根据标准检测方案，采用基于高灵敏度电化学发光的多重阵列测定目标鼻腔免疫介质的浓度。
在对620名新生儿的代表性分析中，大多数检测的免疫介质表现出较低的检出水平。近一半样本中的干扰素γ（IFN gamma）水平低于最低检测限，而肿瘤坏死因子α（TNF alpha）、趋化因子配体4（CCL4）和转化生长因子β（TGF beta）的水平在不到1%的样本中低于最低检测限。如热图所示，20种可检测介质水平之间存在显著的多重共线性。
在无症状的肠道病毒科病毒感染新生儿中，观察到以1型免疫介质为主的上调特征，提示定植细菌和病毒在生命最早期具有触发免疫的作用。研究还发现，出生时家中有兄弟姐妹与特定的1型和17型黏膜免疫应答之间存在关联，并有证据表明该现象与宫内免疫启动效应相关，且这种相关性与上次分娩以来的时间呈负相关。此外，母亲在孕期接受高剂量维生素D补充与安慰剂相比，其子代表现出特定免疫介质的上调，提示维生素D可促进一种独立于病毒、细菌、兄弟姐妹或母亲特应性所诱导的抗菌免疫应答。
这种微量取样方法也可通过支气管镜进行，从而能够研究下呼吸道中的免疫介质。观看本视频后，您应能够充分理解如何在新生儿和较大儿童体内测量未受刺激的气道黏膜中的介质。
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概述
本方案描述了一种非侵入性技术，用于采集上呼吸道未受干扰的黏膜衬液。该方法可对所有年龄段受试者体内蛋白质介质（如细胞因子和趋化因子）的水平进行定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 呼吸系统疾病
- 免疫学
- 儿科学
背景
- 该方法可在无需刺激操作的情况下研究气道的局部免疫特征。
- 适用于儿童呼吸道疾病，如感染、哮喘和过敏。
- 该技术能够在体内检测未受刺激的气道黏膜中低水平的免疫介质。
- 本操作由 Wolsk 博士进行示范。
研究目的
- 研究呼吸道黏膜的免疫反应。
- 深入了解儿童呼吸系统疾病。
- 促进科研中无创采样技术的应用。
使用的方法
- 采集上呼吸道黏膜衬液。
- 使用纤维状羟基聚酯滤膜片进行样本采集。
- 观察新生儿呼吸道感染症状。
- 对采集样本中的细胞因子和趋化因子进行定量分析。
主要结果
- 无需侵入性操作即可成功采集黏膜衬层液体。
- 能够在体内测量免疫介质。
- 深入了解儿科患者的免疫特征。
- 在呼吸系统疾病研究中具有潜在应用价值。
结论
- 非侵入性采样方法对研究气道免疫具有有效性。
- 该技术可促进儿童呼吸健康领域的研究。
- 未来的研究可进一步拓展与免疫介质相关的研究发现。
常见问题
行业重要性概述
这种无创的黏膜衬液采样方法能够在无需刺激的情况下，直接定量上呼吸道黏膜中的体内免疫介质，从而提供反映气道免疫活性的生理相关读数。该技术可支持生命早期的免疫谱型分析和纵向监测，通过将遗传和环境暴露与免疫表型关联，助力呼吸系统治疗药物研发中的机制性风险排除。其在新生儿和儿童队列中的应用，对于哮喘、过敏及感染性疾病等情境下的疾病内型分型预测和疾病进展监测具有重要价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测未刺激黏膜组织中免疫介质的基础水平和诱导水平，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：为儿科人群中的功能靶点验证提供一种可重复、微创的检测基质。
- 预测价值：通过将介质谱与临床表型（如无症状病毒感染及兄弟姐妹接触效应）相关联，支持生物学风险的降低。
筛选与检测方法开发
- 检测适用性：生成的洗脱蛋白样品适用于高灵敏度电化学发光多重阵列，可用于定量免疫分析。
- 标准化：采用一致的滤纸吸附和洗脱流程，确保在不同受试者和时间点间分析物的可重复回收。
- 可扩展性：已在大型新生儿队列（n=620）中验证可行性，支持在流行病学和干预性研究中进行高通量筛查应用。
转化与临床前研究
- 转化连续性：实现从出生到儿童期的纵向采样，将生命早期的免疫特征与后续呼吸系统疾病结局相关联。
- 生物标志物一致性：在无症状的鼻病毒新生儿感染者中检测到Ⅰ型和ⅩⅦ型免疫介质的上调，提示其在识别免疫内型方面的应用价值。
- 机制性风险降低：揭示母体补充维生素D与抗菌免疫反应之间的关联，为免疫调节干预措施的靶点优先排序提供支持。
流程与工作流整合
该方法通过在体内直接测量免疫介质，适用于发现生物学阶段，可在先导化合物确定之前为靶点选择和通路阐明提供依据。
- 发现生物学：支持在无需体外操作或受刺激产生伪影的情况下，对黏膜组织中免疫通路的激活进行假设检验。
- 筛选：产生适用于多重免疫检测读数的标准洗脱液，便于在不同处理或暴露组之间进行比较分析。
- 分析：生成定量的介质水平数据，可用于统计评估共线性、免疫网络活性及表型关联。
- 转化研究：将新生儿免疫特征与儿童期呼吸道症状及环境暴露相联系，支持基于风险分层的推进决策。
- 企业级复用：代表一种适用于多种呼吸系统疾病模型和治疗方式的平台兼容性采样技术。
运营与企业影响
- 科学价值：通过捕获天然黏膜微环境中的内源性免疫活性，为目标验证提供可预测的可信度。
- 操作价值：通过标准化的采集、洗脱和储存流程确保可重复性，最大限度减少分析前变异。
- 战略价值：将免疫调节机制与生命早期免疫特征相关联，优化“推进/终止”决策，降低呼吸系统项目后期的生物学风险。
- 项目组合影响：基于候选物在相关的人源纵向模型中对黏膜免疫通路产生的明确作用，实现风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要接受新生儿气道解剖学和轻柔采样技术的培训，以确保受试者舒适和样本完整性。
- 依赖超滤管、微孔板振荡器以及电化学发光免疫分析设备等基础设施进行分析物检测。
- 需要使用蛋白酶抑制剂配制标准化缓冲液，以防止提取过程中介质降解。
- 当应用于较大儿童或其它黏膜部位时，需调整采样时间或滤膜尺寸。
- 受限于分析物丰度，部分介质常低于检测限，需优化检测方法的灵敏度以检测低表达靶标。
