研究味觉编码的新方法

这些方法的总体目标是通过在体内记录多个受体神经元的活动，同时精确控制和监测味觉刺激物的脉冲递送，来研究简单动物曼迪-卡斯卡（mandi-casecsta）的味觉编码机制。这些方法有助于回答关于味觉的关键问题，例如味觉刺激物如何被一群味觉受体神经元编码。该技术的主要优势在于，能够在精确递送味觉刺激物之前、期间和之后，对多个味觉神经元进行体内记录。

初次接触该方法的人可能会发现该操作具有挑战性，因为解剖过程较为复杂。鉴于此，我们希望本方法的可视化演示能够提供帮助。这些技术由萨姆·赖特（Sam Writer）在我实验室攻读研究生期间与阿莱哈德拉共同开发，由孙奎（Kui Sun）演示这些操作步骤。

羽化后三天，选择一只外观健康的雌雄蛾均可的个体。翅膀应完全伸展，喙和触角应形态完整且无损伤。在通风橱中，将选好的蛾放入固定管中，直至头部露出。

然后，将滤纸插入管子的另一端以固定蛾子。接着，使用注射器提供的加压空气，清除暴露的头部上的毛。随后，将管子放置在培养皿中的黏土平台上。

将头部背侧朝上放置。接着，保护触角和喙。首先，用200微升移液器吸头切成半厘米长的小段，分别为每个结构制作保护套。

为了操控喙，可用一段金属丝制作一个钩子。将喙伸入其中一个盖子中，直至喙的最基部受到保护。使用坚固的蜡将管子固定在头壳的背侧。

接下来，小心地将触角展开，并用蜡封固定管子。现在，通过切断扣带缩肌来稳定脑部。在解剖显微镜下，使用显微解剖工具在喙下方稍作切割，打开头壳。

为确认肌肉已被切断，向喙的远端三分之二部分提供蔗糖溶液，并在五分钟内确保喙不发生伸展。随后，用一层融化的蜡封闭头壳。为了用生理盐水灌注脑组织，在头部腹侧周围构建一个蜡杯。

使用电动蜡笔，从前向后在头部前方开始构建一个蜡杯。将喙和触角管保持在蜡杯内部。继续向外和向上构建蜡杯，直到达到眼睛的水平位置。

使用镊子取下唇须，并用熔化的石蜡将其固定在石蜡杯上。接着，用一层薄薄的双组分环氧树脂密封石蜡杯和管子上的所有开口。使用牙签混合环氧树脂。

首先，覆盖杯子的外表面和内表面。其次，填充固定管中环绕颈部的部分，以更牢固地固定头部。20分钟后，检查杯子是否有泄漏。

开始脑部手术时，首先切除唇须。要打开头部囊的腹侧，沿头部后方和前方以及眼睛周围切开角质层。然后沿头部后方切开，并在靠近喙的头部前方进行更多切割。

然后用镊子轻轻抬起头壳瓣以暴露脑部。现在进行最关键的一步，暴露咽侧神经节（SEZ）和上颌神经。缓慢而仔细地去除脂肪组织和气管。

用新鲜的生理盐水频繁冲洗脑组织。操作需格外小心，因为上颌神经非常容易被压碎。当SEZ和上颌神经最终暴露可见时，其表面将覆盖有一层薄薄的鞘膜。

为了去除该鞘膜，先排尽多余的生理盐水，然后使用10%胶原酶-分散酶溶液处理以削弱鞘膜。浸泡5分钟后，用生理盐水多次冲洗去除溶液。随后，再用生理盐水冲洗数次，使用超细显微解剖镊子轻轻去除鞘膜。

最后，将生理盐水滴注管路固定到灌流杯中。本部分介绍如何构建和使用味觉刺激物递送系统。该系统由一个带有多个开口的测试管组成。

这些开口可供动物的喙器、呈味物质多路管、颜色传感器进入，同时也允许水流通过。构建该系统时，首先准备一根用于喙器的测试管。使用电烙铁制作一个与喙器大小相匹配的孔。

然后，在管内构建一个带筛网的区域，以固定喙部。在孔上方5毫米处剪断，将筛网用石蜡固定于此处，并使用石蜡和环氧树脂重新连接管段。采用加压灌注系统递送味觉刺激物。

根据需要将多个呈味物质管连接至歧管。连接呈味物质输出管时，在筛网上方约一厘米处打孔，然后用环氧树脂将输出管固定在该孔处。每种呈味物质中均需加入一种人工染料，以便被颜色传感器检测。

在距筛网约半厘米的孔处将颜色传感器连接到装置上，并使用环氧树脂将其固定。使用蠕动泵通过硅胶管将蒸馏水注入系统。用一个大容器收集废水。

使用气动泵通过空气脉冲递送味觉刺激物。现在开始通过管路泵入清水，并递送味觉刺激物脉冲以测试颜色传感器。接着，将蛾子喙的三分之二插入测试管中。

使用镊子将喙伸出，并轻轻将其推入孔中。然后用软质牙科蜡和一层环氧树脂将喙固定。现在连接生理盐水灌注管路并设定灌注流速。

然后，将绞合导线四极电极的接地电极浸入生理盐水浴中。接着，使用显微操作器将电极置于上颌神经附近，并缓慢推进至神经内部。在检测到放电信号后，让制备样本至少稳定10分钟，然后开始记录信号。

使用所述方案，在呈递味觉刺激物之前、期间和之后记录味觉受体神经元的电活动。通过颜色传感器监测每种味觉刺激物持续一秒脉冲的起始和终止。每种味觉刺激物均引发可在四个通道中检测到的动作电位。

在脉冲序列中，可以观察到单个的动作电位。使用脉冲分类软件将这些脉冲分配给不同的神经元。三种不同的味觉感受神经元对依次呈现的六种味觉刺激物的反应，显示出不同的基础活动水平以及对味觉刺激物的选择性。

此外，反应的时间特征也各不相同。有些反应与刺激持续时间同步，而另一些则持续时间超过刺激本身。还可使用传统的尖端玻璃微电极对味觉感受器轴突进行细胞内记录。

细胞内记录的结果与使用所述四极记录技术所观察到的反应非常相似，但四极记录更易于操作，持续时间更长，且更为稳定。观看本视频后，您应能够暴露 mandi-casecsta 的上颌神经和食管下区，并能够构建一个具有精确时间控制的味觉刺激递送系统。在执行该实验方案时，请佩戴实验室安全手套和口罩，因为 mandi-casecsta 脱落的细粉末状鳞片可能引起过敏反应。

一旦掌握，该操作可在三个半小时内完成。通过此方法，还可同时记录多个脑区的活动，以回答更多问题，例如：味觉受体神经元对味觉刺激物的反应在传递至突触后靶神经元时是如何被转化的。