定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

本实验的总体目标是可视化并量化细胞黏附初始阶段发生的区室化翻译事件。该方法具有广泛的应用性，可在需要检测快速特异性翻译反应时使用，例如分析细胞迁移、黏附或早期药物反应时。

该技术的主要优势在于操作简便、快速且成本低廉。仅需嘌呤霉素、抗嘌呤霉素抗体以及标准的共聚焦扫描成像系统。首先，制备 MRC-5 细胞的悬浮液。

采用胰蛋白酶消化法，随后进行离心，弃去上清液，然后在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中重悬细胞，细胞密度为每毫升4万个。将细胞悬液在温和旋转条件下孵育20分钟，以彻底解离黏着斑复合物。此步骤至关重要。

接下来，将两份2毫升等分的悬液分别加入两个35毫米的玻璃底培养皿中，孵育以促进细胞贴壁和SiC的形成。40分钟后，向其中一个培养皿加入环己酰亚胺处理，并将其放回培养箱中。该培养皿将作为阴性对照。

55分钟后，向两个培养皿中加入预先确定浓度的嘌呤霉素，并继续孵育5分钟。接种1小时并与嘌呤霉素共同作用5分钟后，用2毫升冰预冷的PBS洗涤每个培养皿两次。然后在室温下用1毫升含4%多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟。

固定后，用 PBS 洗涤细胞三次，然后在室温下用 500 微升含 0.5% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 20 分钟以进行透化。接着，用 PBS 洗涤培养板三次，再加入 500 微升含 1% BSA 的 PBS。继续在室温下孵育 20 分钟。

为去除多余的BSA，用含0.1% Tween-20的PBS洗涤细胞三次。随后，加入300 µL抗嘌呤霉素抗体孵育细胞。用含0.1% Tween-20的PBS洗涤三次，去除未结合的抗体。

接下来，加入300 µL两种荧光素标记的二抗混合液，以同时显示嘌呤霉素修饰的多肽和de factem。将细胞在室温避光条件下孵育1小时。孵育1小时后，用洗涤液洗涤培养板3次，以去除未结合的抗体，随后加入300 µL含DAPI的0.1% Tween-20溶液。

室温下让 DAPI 孵育细胞五分钟。最后再用纯 PBS 洗涤细胞四次，最后一次使用纯 PBS 完成洗涤。然后将细胞置于两毫升 PBS 中保存，用于成像。

使用任何市售的共聚焦成像系统，首先确定能够最大化定量动态范围的适当设置。只有避免信号峰值饱和并正确调整浓度，才能实现准确的定量分析。该设置可通过仔细调节激光功率增益和偏移量来实现。

首先，根据奈奎斯特采样定理调整缩放倍数和像素数量，以优化像素大小。接着，降低扫描速度并使用平均化技术以提高信噪比。

然后，手动确定沿 Z 轴的合适顶部和底部焦平面，并通过计算轴向分辨率并将该距离除以 2.3 来设置步进距离（StepSize）。通常可获得 20 至 25 层图像。参数优化后，使用数值孔径为 1.42 的 60 倍平场复消色差油镜物镜，对单个完整细胞采集共聚焦图像。

为了定量和分析荧光信号，首先在 ImageJ 中打开对应于感兴趣 z 平面层的图像。然后，使用绘图工具在需要定量的细胞位置画一条线。接下来，通过双击“直线”来修改线条的宽度。强度值将沿线条的宽度进行平均，因此应使用较细的线条以避免来自不同结构的信号重叠。

然后，沿该直线分析信号密度。接下来，在对应于荧光染料的通道中，重复沿同一直线采集信号密度的过程。所得数值将始终按照直线的方向进行排序。

现在，复制轮廓数据并将其粘贴到电子表格中进行分析。在进行统计分析之前，重复此过程，从每个感兴趣的 Z 平面图像中收集数据。或者，也可以不沿轴收集信号，而是从图像的某一区域收集信号。

首先使用几何形状功能选择感兴趣区域。然后调整阈值水平以避免任何背景干扰。在像素强度的直方图中，移动滑块以调整哪些像素将被包含在定量分析中。

设置阈值以消除细胞外的所有红色像素。现在，定义用于测量目标信号而非背景信号的测量参数。切换至阈值和总密度选项。

接下来，使用测量命令。这将打开一个新窗口，显示所选区域的平均灰度值和像素数量。然后重复该过程，应用相同的阈值来确定整个细胞中的信号强度。

然后利用这些数据计算所选区域信号与整个细胞信号的比值。为了利用嘌呤霉素掺入法准确测量翻译事件，首先评估了轴向测量的最佳条件。比较了不同浓度在五分钟或十分钟处理下的效果。

MRC-5 和 HeLa 细胞可耐受的嘌呤霉素浓度略高于 Huh-7 细胞所需浓度。用高浓度嘌呤霉素处理十分钟的细胞主要产生较小的嘌呤霉素化多肽。这些较小的多肽扩散速度更快，因此并不理想。

因此，较短的孵育时间被认为更为理想。环己酰亚胺处理是一种有效且重要的阴性对照。在MRC-5细胞中，经环己酰亚胺处理后仅检测到微弱的嘌呤霉素信号。

通过轴向信号定量分析，可以在细胞的不同层面评估对应于新合成蛋白质的嘌呤霉素修饰多肽的一般定位情况。同时，也可实现对细胞内信号定量分布的分析。对于这两种技术而言，对图像堆栈中每个Z平面的信号进行定量至关重要，以准确评估整个细胞中的翻译事件。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何评估亚细胞区室中的翻译事件。一旦熟练掌握，只要操作得当，该技术可在一天内完成。在进行该实验时，重要的是要记住，嘌呤霉素的浓度及其孵育时间非常关键。

为了限制扩散，最好缩短孵育时间。还需要注意，图像采集方式的质量对获得良好结果至关重要。请勿忘记，甲醛操作可能极为危险，因此在进行本实验时，应始终采取预防措施，例如在通风橱中操作。