人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

本方法的总体目标是将人源细胞载体支架植入小鼠体内，以构建人源化骨髓微环境，并对植入物内人源细胞的行为进行活体成像。该方法将有助于回答人类造血领域的关键科学问题，因为它能够以单细胞分辨率重现并实时成像骨髓微环境的各个组分。该系统的多功能性是其主要优势之一，允许逐个或联合植入不同的微环境组分。

该方法有可能应用于其他研究领域，例如肿瘤转移或药物筛选研究。采用适当的无菌技术，首先将灭菌明胶海绵切成24个大小相近的片状。通过将明胶支架浸入乙醇，随后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中进行再水化。

然后用无菌纸巾轻轻蘸去每个支架上的多余液体，并将支架转移至超低吸附24孔板的各个孔中。使用胰岛素注射器，将50微升培养基中含1×10⁵至1×10⁶个基质细胞小心注入每个支架内，随后将培养板放入细胞培养箱中。在向支架内注射细胞时，应确保无细胞悬液从支架中渗出。

一小时后，向每个孔中加入三毫升新鲜细胞培养基，并将支架放回培养箱。24小时后，向支架中注射1 × 10⁵个造血细胞，随后进行培养并添加培养基，再按照上述方法继续培养24小时。对于重组人骨形态发生蛋白2载体支架的制备，将重悬后的支架分别放入U型底96孔板的各个孔中，并向每个支架加入5 µL重组人骨形态发生蛋白2。

然后用20 µL凝血酶和20 µL纤维蛋白原覆盖支架。对于生物工程支架的外科植入，首先剃除实验小鼠背部的手术区域毛发，并用浸有稀释氯己定的棉签在暴露的皮肤表面每个方向擦拭三次进行清洁。接着，使用无菌镊子和手术刀在皮肤上做一个0.5至0.7 cm的前后方向切口，将镊子插入皮下组织下方以形成一个皮下囊袋。

将支架深入插入囊袋中，并用手术胶水闭合切口。植入支架后，培养8至24周再进行取出。静脉注射荧光物质并处死动物后，按前述方法对皮肤进行消毒，在动物背部靠近原植入部位处做一纵向皮肤切口。

小心地将皮肤与植入支架的皮下囊分离，然后用镊子轻轻夹住支架，并仔细剪除支架周围残留的膜和组织，以回收支架结构。使用速干型粘合胶将支架固定在35 mm × 10 mL的培养皿上。对于含有骨形态发生蛋白2的支架，在向培养皿中加入PBS之前，需在显微外科手术显微镜下使用外科微型钻头对骨表面进行减薄处理，以便观察荧光团并实现高分辨率图像采集。

在钻孔过程中需格外小心，因为不同支架的骨厚度通常存在差异，应注意避免破坏表面。用室温 PBS 填充培养皿。进行生物工程支架的双光子显微成像时，将支架放置在共聚焦显微镜载物台上，并选择 20 倍、1.0 数值孔径的水浸物镜。

然后，在成像软件的采集模式下，选中显示手动工具选项。在激光器菜单中，打开双光子激光器，并让激光器预热并稳定。当激光器准备就绪后，在成像设置菜单中，启用通道模式并设置为每帧切换轨道。

在光路菜单中选择非扫描和主分光镜 MBS 760 plus。激活四个非扫描探测器，并按照示意图所示设置配置。在通道菜单中，将激光波长设置为 890 纳米，功率设置为 50%。将主增益设为 500 至 600，数字偏移设为零，每个通道的数字增益设为 15。

在采集模式下，设置适当的参数以获得高分辨率图像，同时避免损伤组织和漂白荧光染料。然后将放大倍数设为1，进行图像的初始扫描。当所有参数设置完毕后，降低物镜直至其接触盐溶液，并使用光源灯手动调节物镜焦距。

现在激活Z轴层扫菜单，选择首尾功能。设置相邻两层切片之间所需的间隔距离，并选择“实时”模式以对样品进行实时扫描成像，根据需要调整数字增益和数字偏移，以获得最佳曝光效果。如需同时观察多个通道，请选择分屏功能。

在活体模式下，于阶段菜单中扫描图像，并标记感兴趣区域，例如骨腔的位置。当样本扫描完成后，移动至第一个感兴趣区域，使用活体模式中的“设置首个”和“设置末个”功能，确定围绕该感兴趣区域的三维Z轴堆叠图像的顶部和底部位置。然后设定中心点C，点击“开始实验”按钮，以开始对该感兴趣区域进行Z轴堆叠图像采集。

图像采集完成后，将图像保存至指定文件夹，并扫描下一个感兴趣区域。在这些代表性图像中，可观察到植入免疫缺陷型 NSG 小鼠体内八周后回收的不同支架材料的大体形态。与人内皮细胞共接种可增加支架的血管化程度，而添加重组人骨形态发生蛋白 2 则可诱导骨形成。

通过活体双光子显微镜成像的这些支架显示了支架中存在血管，以及人源造血细胞在支架实质中的长期植入。接种了人源内皮细胞和间充质基质细胞的支架表明，人源内皮细胞参与了支架内血管的形成，从而产生了小鼠-人源嵌合血管系统。骨组织的形成可通过双光子显微镜观察到，同时还能观察到类骨髓内膜组织中人源化血管系统内腔隙的形成，其形态高度类似于骨髓内膜组织。

此外，在重组人骨形态发生蛋白的两种载体支架中，支架内组织的形态类似于成熟的骨髓脂肪组织，表明人源间充质基质细胞也参与了脂肪组织的形成。观看本视频后，您应充分了解所有生物工程操作及主要的小鼠支架。务必始终维持无菌环境，并在处理支架时格外小心。

需注意该方法的相关局限性，例如组织中存在人-小鼠嵌合体。请记住，成像后样品仍可用于进一步研究，因为支架可被消化，从而能够从中回收活细胞。