研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

在大脑中动脉闭塞模型的皮质-纹状体脑片模型中，酸中毒治疗的总体目标是研究酸性后处理对脑缺血的神经保护作用。该方法有助于回答酸中毒后处理如何保护缺血性脑损伤的关键问题，并为卒中治疗开发新策略。该技术的主要优势在于能够利用广泛可用的实验模型来研究酸中毒后处理的神经保护作用。

演示该操作的是我实验室的研究生 Yarong Zheng。首先，用一把薄的刮铲从断头小鼠的颅骨中取出脑组织，并小心地将其放入一个含有冰冻的常规人工脑脊液（ACSF）的烧杯中，该溶液需预先用5%二氧化碳和95%氧气平衡。在振动切片机的载物台上以两条带状涂抹冷冻沉淀胶。

将一块3%琼脂糖放置在远离刀片的胶条处，以支撑脑组织。然后用镊子将脑组织转移至滤纸上。用刀片切除额极和小脑。

将脑组织垂直放置在胶水的自由端上，使脑组织紧靠琼脂糖。向切片储液槽中加入冰冻的ACSF，浸没脑组织，并在冰盒区域加入冰块。保持储液槽中的ACSF持续通入5%二氧化碳和95%氧气进行鼓泡。

将振动切片机设置为切割400微米厚的切片，并将脑组织相对于切割刀片正确放置后，按下启停按钮以开始自动切片。使用尖端剪切过的巴斯德吸管，将五个脑片逐一转移并放入组织储存槽中，槽内为预冷的常规ACSF溶液，并持续通入5%二氧化碳和95%氧气的混合气体。室温孵育30分钟后，将脑片转移至37摄氏度的水浴中孵育10分钟，以恢复突触功能。

将无葡萄糖的人工脑脊液（ACSF）和酸性 ACSF 置于 37 摄氏度水浴中，分别用 5% 二氧化碳和 95% 氮气、20% 二氧化碳和 80% 氧气混合气体通气 30 分钟。小心地将五片脑组织切片中的四片转移至预热至 37 摄氏度的无葡萄糖 ACSF 中，孵育 15 分钟。为研究酸性预处理的时间窗，将一片切片直接从无葡萄糖 ACSF 转移至酸性 ACSF，其余三片切片转移至常规 ACSF 中进行再灌注。

三分钟后，将切片从酸性ACSF转移至常规ACSF中。在常规ACSF中孵育五分钟之后，将其中一片切片从常规ACSF转移至酸性ACSF中的组织托架内，孵育三分钟。再灌注15分钟后，以相同方式转移另一片切片。

未置于酸性ACSF但置于无葡萄糖ACSF中的剩余脑片设为氧糖剥夺组。将脑片从ACSF中转移至含有TTC溶液的24孔板的孔中。在溶液中将脑片展开。

然后在37摄氏度的浅层水浴中孵育30分钟。接下来将组织切片转移至洁净、已称重、用铝箔包裹的1.5毫升离心管中，并测量切片的干重。称重后，按每10体积溶液对应1重量组织的比例，向管中加入乙醇与二甲基亚砜的1:1混合溶液，以提取四氮唑盐还原产物（Formazan）。

避光孵育24小时。次日，将乙醇二甲基亚砜溶液从离心管转移至96孔板中，使用酶标仪在490纳米波长下测定吸光度。首先通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉效果。

然后将连接了激光多普勒血流仪（LDF）探头的麻醉小鼠置于仰卧位，并使用无菌棉线固定。用75%乙醇对颈部剃毛区域的皮肤进行消毒。随后，在颈部做一正中旁切口，用镊子钝性分离软组织，暴露血管。

向暴露的组织滴加一滴生理盐水以保持其湿润。接着，使用眼科镊子将颈总动脉从周围组织和迷走神经中分离出来。注意不要损伤迷走神经。

在颈总动脉远端放置一个微血管夹，并用6-0丝线在近端打一个死结。然后在夹子近端打一个松结，作为临时缝合线。

接下来，使用显微眼科剪在两个结之间靠近死结处做一个小的纵向切口。现在将一根12毫米长、尖端钝化的单丝线通过切口插入动脉腔内，并向前推进几毫米。将松结收紧固定在单丝线的尖端，然后移除夹钳。

然后使用眼科镊子将丝线推进至颈内动脉，直至激光多普勒血流仪（LDF）软件显示血流出现急剧下降。记录闭塞开始时间。随后移除LDF探头，将小鼠置于30摄氏度的培养箱中，维持一小时的闭塞状态。

在阻塞开始后55分钟，用异氟烷重新麻醉动物，并按之前的方法摆好体位。然后打开颈部切口，重新暴露颈总动脉。阻塞期结束后，使用眼科镊子轻轻拉出缝合线以实现再灌注。

然后通过拉紧结将临时缝合线转为永久缝合。为治疗酸中毒，将鼻罩吸入的气体改为20%二氧化碳、20%氧气和60%氮气，持续五分钟。用间断外科缝合法关闭切口后，将小鼠置于30°C的加热笼中，直至小鼠恢复意识。

该直方图显示了本视频中展示的在氧糖剥夺及酸性后处理后对皮质切片进行TTC染色实验的结果。若在氧糖剥夺后立即或5分钟后开始酸中毒处理，则3分钟的处理具有神经保护作用；但如果切片再灌注15分钟后，则无此保护作用。小鼠接受60分钟的中动脉闭塞，并在再灌注后5分钟、50分钟或100分钟时通过吸入20%二氧化碳进行5分钟治疗。

再灌注后24小时，通过两、三、五三苯基四氮唑氯化物染色法对梗死体积进行定量，黑色虚线所示区域为梗死范围。该直方图显示了每种条件下的梗死体积百分比。即使酸性后处理的开始时间延迟至再灌注后50分钟，其神经保护作用仍然显著。

然而，在100分钟时开始的酸中毒治疗并未阻断缺血性损伤。观看视频后，您应充分了解如何在脑片的氧糖剥夺（OGD）模型以及小鼠的MSO模型中研究酸中毒后处理的神经保护作用。在实施这些操作时，必须牢记酸中毒的强度和持续时间对于重现保护效应至关重要。