利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

本实验的总体目标是观察神经干细胞向神经元或胶质细胞谱系分化过程中的细胞行为。该方法有助于回答神经发育领域中的诸多问题，例如对称性与不对称性细胞分裂的作用、细胞周期延长以及细胞生长速率等。该技术的主要优势在于能够长时间观察细胞谱系的演变过程。

这允许在单个谱系中观察神经发生向胶质发生转变的过程，并对亚谱系的神经和胶质前体细胞进行直接比较。首先，在含有冷解剖液的培养皿中取出5到10个e14胚胎的大脑。使用镊子小心地移除皮肤和颅骨，分离出大脑。

在体视显微镜下操作时，使用解剖镊去除脑膜。随后，从中间切开端脑以分离两侧半球。为分离背外侧端脑，沿背内侧曲线以及皮层与亚皮层边界进行切割。

将背外侧端脑转移至含有冰上解剖液的2 mL离心管中，直至所有脑组织完成解剖。背外侧端脑显微解剖后，将组织置于15 mL锥形管中。随后，在4°C条件下，以340 × g离心5分钟，使含有组织的管子在冷解剖液中离心，以沉淀组织。

离心后，用移液器吸除上清液，并加入1 mL 37摄氏度的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液进行化学消化。在37摄氏度下孵育15分钟。孵育结束后，加入2 mL增殖培养基以抑制胰蛋白酶活性。

接下来，将玻璃巴斯德移液管的尖端在燃气灯或本生灯上灼烧数秒，以略微缩小其开口。用胎牛血清（FCS）润洗移液管尖端，使其表面覆盖一层FCS。随后，使用经火焰抛光并涂有FCS的巴斯德移液管，通过反复吹打来机械解离细胞，注意操作时避免产生气泡。

将离解的细胞在4°C、340 ×g条件下离心五分钟。用移液器吸去上清液，然后加入一毫升增殖培养基，使用移液器重悬细胞。用移液器吸去经多聚-D-赖氨酸预处理的培养板中的PBS。然后在培养板底部画一个标记，作为确定零点位置的参考。

第二次用增殖培养基重悬细胞后，使用0.4%台盼蓝溶液对细胞悬液进行1:1稀释。将稀释后的悬液加入计数板载玻片中，计数未染色的活细胞数量。死细胞将呈蓝色。

将细胞用增殖培养基稀释至每毫升含10的6次方个细胞。向24孔组织培养板的每个孔中加入500微升细胞悬液，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。为成像逆转录病毒转导的细胞，将组织培养板放入与温度和二氧化碳控制器相连的成像腔室中，以维持细胞处于37摄氏度和5%二氧化碳的恒定环境。

选择 xy 轴上的一个位置作为零点并校准该零点。每孔选择 10 至 15 个位置，以 10 倍放大倍数进行成像。将软件设置为每 5 分钟采集一次相差图像，每 3 小时采集一次荧光图像，以降低光毒性。

在实验的前三个小时内检查并调整焦距，因为在温度平衡过程中焦距可能会发生变化。七天后，停止图像采集，并进行成像后的免疫细胞化学染色。启动细胞追踪软件，并选择一个用户名。

单击选择您的用户名并继续。浏览并选择 tTt 工作文件夹，以保存谱系树、统计结果和导出的图像。接下来，选择要分析和加载的实验。

如果图像先前已通过 tTt 转换器转换，请点击日志文件转换器，并在日志文件转换器窗口中指定日志文件中两个连续时间点之间的秒数。点击转换整个实验的日志文件。手动或使用程序中显示的选项选择并加载所需的图像。

选择文件、打开、新建菌落。点击追踪，然后点击开始追踪，以在选定位置启动追踪。视频窗口将出现。

使用追踪圆圈选中细胞，然后按下数字零键。软件将跳转至下一帧。继续使用鼠标将追踪圆圈定位在目标细胞周围，并在每一帧中点击零键，以在细胞上添加追踪标记。

使用键1和键3可分别移动到前一帧或后一帧。要删除轨迹标记，只需单击正确位置进行标记，然后按0键。如果细胞已发生分裂，请选择“跟踪”→“停止原因”→“分裂”，然后在细胞编辑窗口中选择其中一个子代细胞，继续跟踪，接着选择“跟踪”→“开始跟踪”。

为了追踪第二个子细胞，在细胞编辑器中选择该细胞并按 F2 键。如果该细胞在显微视频过程中死亡，请选择“apoptosis”（凋亡）。如果细胞离开观察视野或与邻近细胞混杂而无法继续追踪，请选择“lost”（丢失）。如需暂停追踪并稍后继续，请点击“interrupt”（中断）。

在细胞编辑器窗口中，追踪过程中将生成一棵谱系树。要保存谱系树，请在细胞编辑器窗口中选择文件、保存、当前树。要导出包含追踪数据的视频，请关闭追踪模式，然后在视频窗口中选择导出视频。

设置帧的格式范围、每秒帧数和比特率，然后点击开始导出。以下显微照片显示了原代大脑皮层细胞培养物的GFP荧光图像中的相差图像。

在成像的最初几小时内未见GFP表达。随着时间推移，表达GFP的细胞数量逐渐增加，GFP荧光强度也随之增强，如本组图像中黄色箭头所示。此高倍放大图像显示了前一幅图像框选区域内的GFP表达细胞的详细情况。

这些相差显微图像展示了一个细胞分裂的实例。此处可见前体细胞变圆，随后细胞膜收缩，最后完成有丝分裂。这是一个单细胞谱系树的示例。

彩色箭头表示不同的细胞分裂模式，黄色箭头表示对称增殖性分裂。蓝色箭头表示不对称分裂。红色箭头表示对称终末分裂，X 表示细胞死亡。

数字表示前体细胞的细胞周期长度。如果操作得当，该技术可在一到两小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何展示干细胞向神经元或胶质细胞分化过程中细胞谱系进展的细胞行为。