通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型

本实验的总体目标是通过臭氧暴露（O-E）在小鼠中诱导慢性阻塞性肺疾病（C-O-P-D）。这一新型O-E模型有助于表征COPD的潜在发病机制，并可用于新药的筛选。该O-E模型的主要优势在于能够重现COPD患者的病理过程。

它可以在短短六到八周内生成。与我一同演示该操作的是我们团队的研究员 Weijaian Sang。生成臭氧时，使用电发生器和小型气泵，将空气吹入密封的有机玻璃箱内，并通过连接在箱体内外的通风管排出；同时使用臭氧探头监测箱内臭氧的浓度。

当臭氧浓度达到每百万2.5份时，将小鼠放入箱中暴露3小时。第7周结束时，按照标准操作流程对经臭氧处理的小鼠进行微型计算机断层扫描成像。为检测臭氧诱导的改变及肺疲劳等功能能力，首先在跑台上以每分钟10米的速度使小鼠预热。

5分钟后，将速度增加至每分钟15米，持续10分钟。此后每30分钟将速度增加每分钟5米，直至小鼠无法继续奔跑为止。分别记录每只动物的总奔跑距离和奔跑时间，作为疲劳距离和疲劳时间。

为了测量经臭氧暴露动物的肺功能，将一只麻醉后的小鼠放入与计算机控制的呼吸机相连的体容积描记仪中。采用压力控制通气，使麻醉动物的平均呼吸频率维持在每分钟150次，直至获得稳定的呼吸模式，并在每次呼吸周期中实现完全呼气。随后记录呼气开始后前25、50和75毫秒内的用力呼气容积，排除任何不理想的呼吸操作。

在终末麻醉后，使用直径为1毫米的气管内导管，以每洗肺一次1毫升的PBS对动物进行两次肺泡灌洗。收集每只动物的灌洗液等分试样并混合，离心后将上清液收集于液氮中。将沉淀物重悬于新鲜PPS中进行计数，并为每只小鼠配备两个持样器，每个持样器包含一块显微镜载玻片、滤纸卡和漏斗。

向每个漏斗中加入约 100 至 125 微升重悬的细胞。将样品托架装入细胞离心机，离心使细胞沉降到载玻片上。然后根据制造商的说明向细胞加入相应的染色液，并在 400 倍放大倍数下对每只小鼠计数 200 个细胞。

对于心脏采血，通过心脏穿刺从臭氧暴露的动物体内采集约 500 µL 血液，并将血液加入预置冰上的 1.5 mL 离心管中。冰上静置 30 分钟后，离心血液样本，并将血清上清液转移至新管中，于液氮中保存。

随后可根据标准方案通过ELISA检测解冻后的样本，以评估血清细胞因子表达水平。进行肺部形态计量学分析时，在心脏取样后将第一只小鼠置于仰卧位。然后打开胸腔，剥离颈阔肌和气管前肌，以暴露气管环。

取出肺和气管，不要将心脏与肺分离。接下来，使用PE90聚乙烯管将气管插管连接至含有4%多聚甲醛的注射器，用约200微升多聚甲醛完全充盈肺组织。然后将肺组织置于含有10毫升新鲜4%多聚甲醛的15毫升离心管中，固定至少4小时。

通过微型计算机断层扫描评估，臭氧暴露小鼠的总肺容积和低衰减区域百分比显著大于暴露于环境空气的对照组动物。肺气肿表型还表现为肺泡扩大以及平均线性截距增加。通过体积描记法对肺功能进行评估显示，臭氧暴露小鼠各项降低的参数均与慢性阻塞性肺疾病患者中观察到的典型肺功能缺陷一致。

此外，臭氧暴露在运动耐受性测试中显著缩短了疲劳时间和疲劳距离。经臭氧处理的动物还表现出炎症细胞（包括巨噬细胞和中性粒细胞）显著增加，同时IL-10显著减少，IL-1β和TNF-α显著升高，表明臭氧暴露模型可重现类似人类慢性阻塞性肺疾病（COPD）的症状。在其他小鼠品系（如C57 BR6小鼠）中应用该操作流程，可用于建立此臭氧暴露（OE）模型。该技术建立后，将为肺部疾病领域的研究人员探索COPD的潜在发病机制提供重要基础。

请注意，使用多聚甲醛可能存在危险，操作该试剂时应始终采取预防措施，例如佩戴手套、护目镜，并在通风橱内使用该溶液。