斑马鱼RNA测序基因表达数据的样本制备与分析

本研究对斑马鱼幼体样本进行RNA测序分析的总体目标是鉴定斑马鱼胚胎和幼体的基因表达谱，并对不同样本间的基因表达变化做出定量比较。该方法可用于回答多个研究领域中的关键问题，只要这些领域中斑马鱼胚胎或幼体具有信息价值，例如：在与其他条件相比时，特定靶基因的抑制如何引起基因表达的变化或导致某些通路的紊乱。该技术的主要优势在于斑马鱼易于大量繁殖，且可方便地获取整个生物体的转录组数据。

此外，利用转基因动物的分选可以轻松实现特定细胞类型的分离。演示该实验操作的是我实验室的研究生莱恩·霍斯特利（Lain Hostelley）和博士后杰西卡·内史密斯（Jessica Nesmith）。首先，将胚胎培养至三个月龄，即达到生殖成熟阶段。

在收集胚胎的前一晚，将两条雄性成鱼和三条雌性成鱼从目标品系中分离出来，放入装有新鲜系统水的分隔式交配缸中。次日早晨开灯后，移除隔板，让鱼自然交配，直至观察到鱼缸底部出现胚胎。每隔30分钟收集一次胚胎，分别置于含有胚胎培养基的培养皿中，直至收集到所需数量的胚胎。

为进行胚胎分期，将每50至75个胚胎作为一组培养在直径10厘米的培养皿中，以促进所有胚胎发育时间的一致性。随后将培养皿置于28.5摄氏度条件下。在原肠胚形成后至受精后约24小时（HPF）期间，通过体节数量来测定胚胎年龄，并根据发育年龄对胚胎进行分组。

根据文本方案中所述，在目标阶段处死胚胎后，将约20个胚胎转移至已标记的1.5毫升微量离心管中。随后，移除微量离心管中多余的胚胎培养基。向管中加入200 µL裂解试剂。

使用研杵对胚胎进行机械匀浆。然后，加入额外的800微升裂解试剂，使总体积达到1毫升。为了提取RNA，向收集的样品中加入裂解试剂，并在室温下孵育5分钟。

每使用1毫升裂解试剂，加入0.2毫升氯仿，用手倒置离心管15秒。将样品在室温下孵育2至3分钟后，在4摄氏度条件下以12,000 × g离心15分钟。将分离后的水相转移至新的离心管中，每使用1毫升裂解试剂加入0.5毫升异丙醇。

室温孵育试管10分钟后，将样品离心10分钟。接着，向RNA中加入75%乙醇，并在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟。彻底去除上清液，将样品置于室温下空气干燥。

然后，将RNA重新悬浮于15至30微升经DEPC处理的水中。在按照文本方案提取沉淀并洗涤样品后，为纯化高质量RNA，使用吸收光谱仪检测所提取RNA的浓度和纯度。在将RNA样品送至供应商或公司进行基于测序读长定量的RNA测序及基因表达变化分析之前，确保A260/A230比值约为2.0。

为了比较单个实验条件与对照条件，使用电子表格管理软件打开差异表达基因的数据。点击排序按钮旁的下拉箭头，在电子表格中选择自定义排序。在弹出的窗口中，选择“列”下方的框，并选择按 LFC 列进行排序。

在“排序依据列”中，确保已选择“数值”。在“顺序列”中，选择按从大到小的顺序排序，然后单击“确定”。为了确定在两种实验条件下差异表达的基因，在实验组与对照组的电子表格中，选择空白列的第一个单元格。

然后，在单元格中输入以下方程。按 Enter 键或 Return 键以运行该方程。选中包含该方程的单元格，然后单击单元格右下角的方框。

按住鼠标并向下拖动所选区域，直至选中要复制公式的列中最后一个特征 ID，从而将公式填入该列的每个单元格。再次选择自定义排序，并通过点击左下角的加号图标添加第二级排序。在第一级排序中，按列选择“duplicate”进行排序。

在“排序依据”下选择“数值”，在“次序”下选择“Z 到 A”。在第二级排序中，“然后依据”下的“列”选择 LFC。在“排序依据”下选择“数值”，在“次序”下选择“从大到小”，然后点击“确定”。在继续操作前，若需去除基因符号列中的所有括号，请选中包含基因符号的整列。

在下拉文件菜单中选择“编辑”，然后选择“替换”。在“查找内容”栏中输入左括号、星号、右括号，即“(*)”，并将“替换为”栏留空。选择“全部替换”以删除所有括号实例。

为了确定富集的通路，将目标基因符号复制到剪贴板。前往 ConsensusPathDB 网站，然后在网页左侧边栏选择基因集分析，接着选择过度代表分析。在“粘贴基因和蛋白质标识符列表”框中，粘贴基因列表。

在基因/蛋白质标识符类型框中选择基因符号，然后点击继续。在基于通路的集合部分，勾选路径由通路数据库定义旁边的复选框。选择查找富集集合，以获得包含输入列表中基因的通路列表。

通过勾选通路名称旁的每个复选框，或点击复选框列标题上方“选择”下方的“全部”，来选择所有富集通路，以在通路网络中进行可视化。然后，点击“可视化所选集合”。通过点击页面顶部中央的“相对重叠”或“共有候选分子”筛选条件，并输入所需的百分比、相对重叠值或共有候选分子数量，然后点击“应用”，以调整相应的筛选参数。

为了确定富集的基因本体，将相应基因组的基因符号复制到剪贴板。前往基因本体联盟（Gene Ontology Consortium）的 GO 富集分析工具。在页面左侧的“在此处输入您的基因 ID”部分，将基因符号列表粘贴到输入框中。

在基因 ID 框下方，选择 GO 术语“生物过程”。然后在 GO 术语框下方选择 danio rerio，然后点击提交。根据文本方案进行 QRT-PCR，并与 RNA-Seq 进行比较。

对注射了针对 alms1 或 bbs1 的 Morpholino 的幼虫提取 RNA 进行测序，揭示了在 Alstrom 和 BBS 模型中特异性上调和下调的基因，以及在两种模型中均发生显著变化的基因。为了更清晰地阐明 Alstrom 模型的分子特征，鉴定了差异表达基因中富集的通路和基因本体。如图所示，共有 31 条通路上调。

除了代谢这一大类之外，受影响最显著的通路是先天性和适应性免疫系统，分别涉及32个和20个基因。B细胞受体信号转导的下游事件也显著富集。在上调基因中，多个信号通路同样呈现富集，这与Alstrom综合征和初级纤毛功能障碍之间的关联一致。

此外，与胰岛素分泌相关的三条通路被上调，分别为与GPR40结合的脂肪酸、游离脂肪酸和乙酰胆碱。最后，在Alstrom模型的上调基因中富集了六个GO术语，包括红细胞分化、红细胞稳态、髓系细胞稳态以及稳态过程。一旦掌握，通路和GO术语分析可在一小时之内完成。

在进行该实验流程时，重要的是要牢记，通路参数和阈值的选择是解读RNASeq表达比较结果时最关键的考虑因素。完成该流程后，还可采用其他方法，如利用突变体品系或对特定细胞类型进行转录组分析，以回答更多科学问题，例如细胞类型的转录组特征分析，以及特定基因调控下的基因表达变化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用RNASeq生成的斑马鱼转录组数据，识别实验样本间显著的基因表达差异。