激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用
2017年9月5日
共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。
本实验的总体目标是利用共聚焦荧光显微镜的激光在细胞的核内特定区域诱导 DNA 损伤。该方法有助于回答有关 DNA 修复的关键问题，例如蛋白质如何被招募并保留在 DNA 损伤位点。该技术的主要优势在于能够实时观察目标蛋白，从而构建其招募与保留的动力学特征。
开始此操作时，将含有目标细胞的腔室载玻片放入维持在37摄氏度和5%二氧化碳的台式培养箱中。使用编码的自动化显微镜载物台注册图像视野。选择培养容器中易于识别的特征，例如各孔之间的屏障。
采集图像并记录X-Y位置。这将有助于在样品制备后对所选视野的X-Y位置进行对齐和配准。图像配准完成后，选择一个视野进行微辐照，并聚焦样品。
对于表达荧光标记蛋白的细胞，应在目标荧光通道中选择核截面最大的焦平面。聚焦于核的最大截面至关重要，因为这可确保焦点位于细胞核中心，从而准确监测目标蛋白向诱导损伤位点的招募情况。选择细胞核内一个清晰的结构（如核仁），并上下移动焦平面，同时观察其形态变化。
真实的焦平面将位于明暗过渡的区域。为样本对焦时，应选择使所选特征具有最清晰对比度的焦平面。下一步是记录感兴趣区域的位置。
在显微镜软件中创建一个 3×3 像素的方形感兴趣区域（ROI）。将该 ROI 置于待损伤细胞的细胞核上方，并将此 ROI 设置为损伤区域。采集包含损伤 ROI 位置的预损伤图像。
获取目标蛋白在荧光通道中包含明场的图像。此时细胞已准备好进行激光微辐照。在本演示中，将使用405纳米激光，功率设为100%。
405纳米激光的剂量通过调节扫描速率并执行一次选定损伤ROI的扫描来控制。在本实验中，使用每秒8帧和0.5帧在405纳米下进行微辐照。选择合适的激光功率以损伤细胞对于区分不同的DNA修复通路至关重要。
在造成损伤后，对明场和荧光通道进行延时成像。根据需要调整延时成像的持续时间和频率，以优化数据采集，理想情况下应能捕捉到荧光蛋白在损伤区域（ROI）的聚集及其在实验时间进程中的解离过程。完成时间序列成像后，选择新的细胞视野进行损伤处理，并继续显微照射及延时成像，直至达到所需损伤细胞数量为止。
每个选定条件下建议选取10至25个细胞。为增加免疫荧光分析的总体细胞数量，可在培养容器内对额外视野区域进行损伤处理，以获得多个视野的损伤后反应时间序列。记录每个视野的X-Y坐标位置以及损伤发生的时间。
可在造成损伤后立即固定细胞，或在固定前让细胞修复一段选定的时间。开始分析时，使用图像分析软件（如 NIS-Elements）打开获取的图像。对于每个待测量的细胞，首先生成一个代表细胞核的参考 ROI。
对包含构成细胞核的像素的荧光信号使用阈值算法，然后将该区域转换为感兴趣区域（ROI）。接着，创建一个6×6像素的ROI，并将其放置在损伤ROI上。此较大的ROI即为用于分析的损伤ROI。
针对每个待测细胞，记录参考区域（ROI）和损伤区域（ROI）的平均荧光强度。对于时间序列中的每一帧，调整参考 ROI，以确保准确覆盖细胞核区域，并调整损伤 ROI，以确保覆盖损伤位点。记录时间序列中每一帧各 ROI 内荧光信号的平均荧光强度。
对每个细胞，将延时成像各帧中损伤区域（ROI）的平均荧光强度归一化为其对应参照区域（ROI）的荧光强度。此处，以平均核荧光强度作为参照区域（ROI），通过从损伤区域（ROI）的平均荧光强度中减去参照区域（ROI）的平均荧光强度来实现归一化。对所有受损细胞以及至少两个未受损的对照细胞重复该归一化过程。
最后，绘制归一化强度值随时间变化的曲线，以显示招募动力学随实验处理的变化情况。稳定表达 XRCC1-GFP 的细胞在诱导损伤前后接受辐照并进行成像。观察到 XRCC1-GFP 向损伤 ROI 区域的招募，并测量了其招募动力学。
使用两种标记物检测双链断裂的形成。对于这两种标记物，355纳米波长下第二次低剂量刺激在照射后5分钟和20分钟均未引发反应，在照射后10分钟仅产生微弱且不稳定的反应。而355纳米波长下10秒的高剂量微照射则在照射后5、10和20分钟内导致损伤ROI区域荧光信号增强，并在40分钟时有所减弱。
这些结果表明，DNA双链断裂标志物在355纳米微辐照下以剂量依赖的方式产生响应。相比之下，无论施加的剂量如何，405纳米激光刺激均导致两种标志物在损伤ROI区域内显著聚集。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约四小时内完成10个细胞的实验。
在执行该技术时，重要的是根据所监测的修复过程调整激光波长和施加的功率。在完成该操作步骤后，可进行免疫荧光实验，以探究其他蛋白质的招募情况，或磷酸化状态及其他翻译后修饰的变化。该技术使研究人员能够研究DNA修复蛋白的动态招募过程，并更深入地确定蛋白结构域和突变如何影响对DNA损伤的识别及响应。
观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用激光扫描共聚焦显微镜诱导DNA损伤并监测DNA修复蛋白的招募过程。请务必注意，操作激光器和甲醛等化学品可能具有极高危险性，在执行该实验流程时，必须始终采取适当的防护措施，例如佩戴个人防护装备。
概述
本研究利用共聚焦荧光显微镜和激光显微照射技术诱导DNA损伤，并实时观察DNA修复蛋白的招募过程。这些技术有助于加深我们对DNA损伤识别与修复机制的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- DNA修复机制
背景
- DNA损伤是影响细胞功能和完整性的关键因素。
- 了解DNA修复蛋白的动态变化对于揭示基因组稳定性机制至关重要。
- 共聚焦显微镜可实现对细胞过程的精确成像。
- 激光显微照射技术可用于诱导局部DNA损伤。
研究目的
- 研究DNA修复蛋白在诱导DNA损伤位点的募集与滞留。
- 分析DNA损伤后随时间变化的蛋白质响应动态。
- 比较不同激光波长对DNA修复通路的影响。
使用的方法
- 将细胞培养在带腔室的载玻片中，并置于受控环境中维持培养。
- 使用共聚焦显微镜注册图像视野并对准细胞核。
- 采用405纳米激光进行激光微辐照，以诱导DNA损伤。
- 通过延时成像捕捉损伤后荧光标记蛋白的募集过程。
主要结果
- 观察并量化了 XRCC1-GFP 向损伤位点的募集。
- 不同激光剂量引发了 DNA 修复标志物的不同反应。
- 延时成像揭示了蛋白质聚集与解离的动力学过程。
- 结果表明，DNA 修复标志物对微辐照存在剂量依赖性响应。
结论
- 该研究成功展示了共聚焦显微镜和激光显微照射技术在DNA修复研究中的应用。
- 实时可视化为修复蛋白的招募动态提供了有价值的见解。
- 这些技术可进一步应用于不同背景下DNA修复机制的深入研究。
常见问题
行业重要性概述
激光微照射结合共聚焦显微镜技术可实现对哺乳动物细胞中DNA链断裂的精确定位诱导与定量分析，有助于在早期发现阶段进行机制性风险评估。该方法可提供关于DNA修复蛋白募集与滞留的实时、定量信息，为靶点验证和通路研究提供依据。该技术提高了针对DNA修复靶点的预测可靠性，并支持在转化研究中做出基于风险评估的项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接检测DNA修复通路的激活及蛋白质招募动态。
- 通过定量分析蛋白质在损伤位点的招募与滞留，支持对DNA修复靶点的功能验证。
- 通过区分单链与双链断裂应答，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
- 为发现阶段的DNA修复靶点筛选提供定量数据支持。
筛选与检测方法开发
- 建立可重复、剂量可控的DNA损伤诱导方法，用于实验标准化。
- 生成定量、时间分辨的蛋白质招募读数，便于开展筛选前准备。
- 支持开发可扩展的检测方法，用于靶向DNA修复通路的化合物评价。
- 可在不同修复蛋白和细胞模型间重复使用该检测平台。
转化与临床前研究
- 将DNA修复动态与疾病相关的细胞环境相整合，推动转化生物标志物的开发。
- 通过在哺乳动物系统中开展机制性研究，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过定量分析修复动力学及修复通路的参与程度，支持基于风险评估的推进决策。
- 有助于评估蛋白质结构域突变及修复过程中翻译后修饰的作用。
流程与工作流整合
该方法通过实现对DNA修复靶点的假设验证、通路阐明以及定量分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：支持对DNA修复机制和蛋白质功能进行假设驱动的深入研究。
- 筛选：为检测方法开发和化合物筛选提供可重复、定量的结果输出。
- 分析：提供时间分辨、归一化的荧光测量数据，用于修复动态的比较分析。
- 转化研究：通过在与疾病相关的系统中实现机制性评估，连接基础发现与临床前研究。
- 企业级复用：提供标准化且可灵活调整的平台，适用于多种DNA修复研究应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高DNA修复靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强DNA损伤与修复检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供可靠的机制数据，改善决策推进或终止（go/no-go）的判断，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的DNA修复靶点优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜技术和定量图像分析的专业知识。
- 需要使用配备激光器的共聚焦显微镜及图像分析软件。
- 要求跨团队在激光剂量、感兴趣区域（ROI）选择和归一化流程方面实现标准化。
- 经适当优化后，可适用于多种细胞模型及修复蛋白的研究。
- 由于涉及激光操作和化学固定步骤，必须采取必要的安全防护措施。
