DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析
2017年9月7日
新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。
该技术的总体目标是提供一种计算工具，用于评估通过免疫染色在细胞核内显示的DNA修饰的空间分布和信号强度。该方法有助于回答表观遗传学领域中的关键问题，使研究人员能够在不同模型系统中检测DNA修饰的细胞核定位及其相对水平。该技术的主要优势在于，能够同时通过信号强度和分布模式来测量DNA修饰。
该技术的一个意义在于，它有助于我们理解各种生物系统中DNA修饰潜在的功能模式。该技术还可进一步应用于通过免疫组织化学检测到的其他表位的计算分析。首先，打开共聚焦显微镜图像的LSM格式文件。
选择图像处理，然后选择用于分析的所需图像。请注意，在比较不同样本之间的强度分布时，必须保持激光功率和增益的一致性，才能进行直接比较。接下来，点击“显示全部”，以显示所有图形控件，然后选择图形选项卡，并选择矩形工具来选定包含目标细胞核的区域。
然后使用“裁剪区域”命令来分离出目标区域。将图像另存为新名称，并选择 LSM 或 CZI 格式，随后在 Zen Blue 软件中重新打开该文件。在 Zen Blue 中打开 ZEN 工作台，然后在 Zen Black 中使用“发送到 ZEN”命令，将文件在 Zen Blue 中打开。
接下来，激活标有 2.5d 的选项卡，以启用图像的 2.5d 可视化。点击“显示全部”，使所有图形控件可见，并使用四个灰色滑块调整设置。这些滑块分别控制缩放、旋转、坐标轴倾斜以及比例尺的扩展与收缩。
选择渲染模式以最佳显示各个峰，然后通过更改百分比来调整高度距离。百分比越低，各个峰的轮廓越清晰。在保存2.5D图像之前，单击2.5D图下方的灰色箭头，隐藏文件列表和图形工具。
然后使用键盘上的打印屏幕键将图表保存为屏幕截图。在软件中打开图像处理选项，并打开目标文件。接着，选择轮廓选项卡，再选择显示全部选项卡，以访问所有格式化选项。
在配置文件选项卡中，选择表格选项和箭头按钮。然后使用鼠标选择一个起点，并沿连续的多个细胞绘制一条线，系统将生成沿此线各细胞的强度分布图以及相应的强度测量值表格。请注意，该表格还提供了像素强度在红、绿、蓝荧光下的距离信息。
单位为微米。要导出此数据，请在表格上单击右键，选择“保存表格”并将其保存为文本文件。要保存强度分布图，请选择导出选项，在弹出窗口中切换两个选项：标记图像文件格式以及图像窗口内容、单窗格、数据。
然后按照提示保存文件。对每个需要的强度轮廓重复此过程。在软件中选择图像处理，并选取感兴趣的图像文件。
然后选择标有“coloc”的标签页以进行共定位分析，并选择“show all”以访问所有格式化选项。在屏幕下半部分的四个标签页中，选择“co-localisation”，并选择表格和图像选项。接着选择该标签页顶部的第三个图标，其弹出文本标识为“closed besier”。
使用此工具圈选单个细胞核。随后，数值将显示在表格中，并生成红色与绿色荧光的散点图。该图的坐标轴可移动，从而控制检测的设门范围。
细胞核内所有像素强度均应视为阳性信号。由于DNA修饰水平在细胞核内分布不均，为纳入弱信号，我们不对数据进行设门。需要强调的是，是否应在分析中包含背景值仍存在争议。
重要的是，重叠系数与两个通道之间的信号强度差异无关。而皮尔逊相关系数则假设信号之间存在线性关系。现在重复此圈选细胞核的过程，以完成整个数据集的采集。
然后，要导出数据，可右键单击表格并按照选项保存数据。要保存共定位图像，请使用导出命令，并选择两个选项：标记图像文件格式以及图像窗口单窗格内容的数据，然后按照提示保存文件。采用所述方案，检测了两种5-甲基胞嘧啶氧化衍生物在分化中的成血样祖细胞中的空间分布情况。
红色和绿色信号代表两种不同的DNA修饰。信号界限清晰，重叠较少。与预期一致，两种信号强度的分布模式及其对应的细胞位置彼此之间没有明显的重合。
这种独特的模式表明，TET依赖的氧化作用可使五种甲基胞嘧啶在特定染色质区域生成不同的氧化衍生物。在Daoy髓母细胞瘤细胞和BXD室管膜瘤细胞中也进行了这两种DNA修饰的类似比较。这两种细胞系均来源于儿童脑肿瘤。
定量结果显示，与Daoy细胞相比，BXD细胞中两种信号水平均显著降低。接下来，在未分化的hiPSCs中检测了5MC氧化衍生物的共定位情况，以及在诱导肝内胚层分化24小时后的hiPSCs中的共定位情况。
在此分析中，随着分化诱导，信号共定位发生了显著变化，这可能归因于未分化细胞中五种 CAC 信号强度的降低。观看本视频后，您应能够充分理解如何生成 2.5D 强度图和轮廓图，以及如何获得共定位数据。本文所述的图像分析与可视化工具为表观遗传学研究提供了支持，可相对快速地比较不同实验组中各类 DNA 修饰信号。
一旦掌握，该技术若操作得当，约需一小时即可完成。进行显微镜观察时，应避免过度曝光，并对不同实验组采用相同的设置。封片中的气泡和浸没不足可能导致局部荧光信号丢失，因此，对扫描区域进行目视检查至关重要。
该流程可通过 Zen Blue 对细胞核进行分割并创建感兴趣区域，从而实现进一步自动化。这些区域可导入 Zen Black，以对多个细胞核进行共定位分析。
概述
本文介绍了一种用于可视化新发现的5-甲基胞嘧啶氧化形式（oxi-mCs）及其在细胞核内空间分布的半定量工作流程。该方法可用于评估DNA修饰的信号强度及其共定位情况，有助于深入理解这些修饰在表观遗传学中的功能作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观遗传学
- DNA修饰
- 免疫染色技术
背景
- 5-甲基胞嘧啶及其氧化衍生物在基因调控中发挥关键作用。
- 了解它们的空间分布可为理解其功能意义提供线索。
- 现有方法可能无法充分可视化这些修饰。
- 本研究介绍了一种计算工具，以增强对这些修饰的可视化与分析能力。
研究目的
- 建立一种用于评估DNA修饰空间分布的方法。
- 分析不同氧化衍生物的信号强度及其共定位情况。
- 促进理解这些修饰在生物系统中的功能作用。
使用的方法
- 细胞核中DNA修饰的免疫染色。
- 使用共聚焦显微镜进行图像采集。
- 使用Zen Blue软件进行图像处理以实现可视化。
- 信号强度的共定位分析。
主要结果
- 在不同细胞类型中观察到氧化衍生物具有不同的空间分布模式。
- 共定位分析揭示了分化过程中发生的显著变化。
- 定量结果显示不同细胞系间的信号水平存在差异。
- 该方法在表观遗传学研究中展现出更广泛的应用潜力。
结论
- 该工作流程可增强DNA修饰的可视化效果。
- 研究结果表明，不同的氧化衍生物具有独特的功能作用。
- 该技术可应用于多种生物学背景，以获得更深入的见解。
常见问题
行业重要性概述
该方法可使生物制药研发团队对细胞核环境中DNA修饰的空间分布和信号强度进行定量评估，从而支持表观遗传靶点验证过程中的机制性风险排除。通过提供对免疫荧光共聚焦图像的计算分析，该方法增强了早期发现阶段的预测可信度，其中对新型表观遗传标记定位的理解有助于治疗假设的验证。该工作流程通过标准化、可重复的定量输出，支持跨职能协作，并可应用于多种模型系统。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过可视化脊椎动物中组织和发育阶段特异性的DNA修饰发生情况，实现对治疗假设的探究。
- 操作价值：通过定量测量细胞核内信号强度和分布模式，支持生物学风险评估。
- 预测价值：通过提供关于5-甲基胞嘧啶氧化衍生物定位的数据，有助于项目筛选，这些衍生物可能在细胞过程中发挥特定作用。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过生成多个细胞的2.5D信号强度图和强度分布图，制备经过验证的生物系统，用于后续分析流程。
- 操作价值：在显微成像过程中采用一致的激光功率和增益设置，解决检测方法的标准化和可重复性问题，实现样本间的直接比较。
- 筛选适用性：通过展示该方法适用于免疫组织化学可检测的其他表位，突出其可扩展性和平台的重复使用潜力。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过分析hiPSCs和儿童脑肿瘤细胞系在分化过程中信号共定位的变化，探讨其与疾病的相关性。
- 风险调整型推进：描述在Daoy髓母细胞瘤和BXD室管膜瘤细胞中对信号水平的定量分析如何支持临床前验证阶段的决策制定。
- 机制性风险降低：通过展示氧化衍生物在染色质特定区域的不同空间分布模式可能反映tap依赖性氧化反应，强调其预测价值。
流程与工作流整合
该方法通过提供支持表观遗传学研究中假设验证与通路阐明的定量成像数据，融入从早期发现到先导化合物鉴定的整个发现流程。
- 发现生物学：通过免疫染色可视化DNA修饰的空间分布分析，阐明该方法如何支持假设检验。
- 筛选：通过信号强度谱型和表格导出描述检测就绪状态，实现跨细胞染色强度的定量比较。
- 分析：突出共定位系数和散点图，帮助研究团队比较不同实验条件并评估不同DNA修饰之间的关系。
- 转化研究：通过干细胞和肿瘤模型分化过程中信号变化的分析，将该方法与临床前研究的连续性相联系。
- 企业级复用：指出该方法可作为可复用的技术能力，因其还可应用于免疫组织化学可检测的其他表位的计算分析。
运营与企业影响
- 科学价值：通过评估细胞核定位及DNA修饰的相对水平，实现对靶点验证的预测性置信度。
- 操作价值：通过一致的成像设置和可导出的数据表，实现标准化与可重复性，便于跨组比较。
- 战略价值：通过比较不同实验组（如未分化与已分化的hiPSCs）中DNA修饰水平，支持更优的“进行/终止”决策。
- 项目组合影响：通过量化不同细胞系间信号差异（如BXD细胞与Daoy细胞中的较低信号），实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜和DNA修饰免疫染色方面的专业科学知识。
- 仪器和分析基础设施需包括Zen Blue软件，用于2.5D可视化、轮廓分析和共定位分析工具。
- 跨团队标准化要求在比较样本间的强度轮廓时，保持激光功率和增益的一致性。
- 该方法已应用于人单倍体前体细胞、Daoy髓母细胞瘤、BXD室管膜瘤及hiPSCs，支持在不同模型系统间的适应性考量。
- 实际局限性包括需避免过度曝光，并检查扫描区域是否存在气泡或浸没液不足，这些因素可能导致局部荧光信号丢失。
