非人灵长类动物光遗传学中大体积、行为相关照明技术

本方案的总体目标是构建一种适用于非人灵长类动物光遗传学操作的大体积组织照明装置。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如，不同脑区的神经元群体如何参与行为调控，以及某一脑区中具有时间特异性的神经元放电模式如何影响其他脑区？该技术的主要优势在于其使用光作为刺激手段，因此能够在造成最小组织损伤的情况下，对与行为相关的大范围脑区进行光遗传学操控。

由于人类与非人灵长类动物大脑之间的相似性，该技术的应用前景可延伸至转化医学领域。通常，初次接触此方法的研究人员会遇到困难，因为在牵拉这些光纤时需要经过一定练习才能掌握适当的压力。开始此操作时，使用一把锋利的剪刀切割一段直径为250 µm的塑料光纤，其长度应比所需的照明装置总长度至少长10 cm。

接下来，使用22号电线剥线钳从塑料光纤一端去除15至20厘米的聚乙烯护套。然后，将光纤剥除护套端最远端的3至5厘米固定在台式台钳中。用一只手握住光纤的带护套端，并保持恒定且稳定的拉力。

光纤应与地面平行，并从夹具上拉离。在整个加热和冷却过程中，需保持光纤处于恒定张力状态，以确保光纤在变细过程中保持笔直和紧绷。使用双温热风枪的最低档位，加热光纤的去涂覆部分，直至其变细至直径60至100微米，或约相当于人类头发的直径。

在让光纤冷却的同时，保持其张力恒定。若未能保持张力或对光纤过热，可能导致光纤卷曲和/或断裂。为在加热过程中帮助维持光纤的恒定张力，建议使用非惯用手操作，以便在使用热风枪时无需松手。

此外，可将光纤轻轻缠绕在手掌上以获得更稳固的握持。待光纤完全冷却并达到所需直径后，从两侧最细处向外3厘米处捏住光纤。沿光纤轴向迅速而有力地拉扯，使两侧分离，形成锥形尖端。

然后，在解剖显微镜下用低倍镜观察拉细的尖端。如果尖端分叉或弯曲，则丢弃该光纤。即使经过大量练习，大约三分之一的光纤尖端仍会出现分叉或弯曲的情况。

我们直接丢弃这些光纤，而不是尝试修复它们，因为重新拉制一根新的光纤非常快速且成本低廉。通过在光纤尖端末端附近贴上一片实验室胶带，使所需长度的尖端暴露出来，以准备刻蚀锥形尖端。此处暴露了最后五毫米。

胶带可保护光纤在预期发光长度以上的部分免受刻蚀。随后，将一小片五微米碳化硅研磨片对折成小方块，夹在拇指与食指之间。将光纤末端置于研磨片的两层之间，用轻微的环形运动轻轻刻蚀光纤。

频繁旋转光纤，使所有侧面均匀蚀刻。接着，使用22号剥线钳从照明器另一端去除约五毫米的聚乙烯护套。然后，用热刀将另一端切平，以使表面光滑。

将连接器固定在照明器末端，远离刻蚀尖端的一端。这使得照明器能够连接到光纤或激光器。随后，使用粒度逐渐增细的研磨片将另一端抛光至平整。

随后，将扁平的另一端插入内径为260微米的不锈钢卡套，直至与卡套末端齐平。使用光纤显微镜目视确认另一端已光滑且均匀地抛光。将卡套垂直粘贴在桌边，使卡套较小的开口端朝下。

然后，用1 mL注射器吸取塑料环氧树脂，并在注射器上安装一根钝头18号针头。接着，使用针头将环氧树脂注入套管内部，确保完全填满套管。

将光纤插入套管中，使其与套管底部齐平。如有需要，在干燥前用沾湿的无尘布擦拭光纤抛光面上多余的环氧树脂。在此步骤中，每次测试前需准备一个塔式微驱动装置。

然后将带有斜面尖端的25号导引管固定在驱动器下方的夹具上。将大容量照明器固定在同一个驱动器上方的夹具中。该夹具连接至驱动电机。

随后，将大容量照明装置完全穿入导管中，并确认照明装置的尖端伸出导管尖端。或者，可在光纤上缠绕实验室胶带，使夹紧部位为胶带而非光纤本身，以保护光纤。接下来，将导管和照明装置浸入消毒液中进行消毒。

在洁净室内部放置一个已定制灭菌、孔距为1毫米的网格，并通过腔室侧面的螺丝将其固定在预设方向上。使用无菌钝头镊子向上拉动照明装置，将其从导管中撤出。照明装置的尖端应位于导管尖端上方5至10毫米处。

将微型驱动装置固定到支架上，并将导管插入目标网格孔中。然后，降低微驱动装置的阶段，直到导管刚好穿过硬脑膜层面。同时，使用无菌镊子手动降低照明器。

如果存在任何阻力，将照明器回撤5至10毫米，等待10分钟，然后再次尝试。如果第二次尝试时仍有阻力，将照明器尖端完全回撤至导引管内，将导引管下调0.25毫米，再重新尝试。将照明器另一端的卡箍连接至更大的光学装置或激光器上。

该图显示，随着光照强度的增加，错误率显著上升。此处的点阵图显示了跨越皮层2.5毫米厚度的神经元抑制情况。局部场电位则显示出跨越4.5毫米的光伪迹。

一旦掌握，使用该技术构建大体积照明装置仅需 10 到 15 分钟，另需加上环氧树脂干燥时间。校准还需额外约半小时，因此为了最大化效率，我们通常会一次性制作多个照明装置。在执行该操作过程中，需要注意的是，许多照明装置可能无法达到质量控制标准。

没关系。如果它们未能通过针尖检查，我们会将其丢弃；但如果校准失败，我们通常会重新抛光并重复校准过程。

该技术开发后，为神经科学领域的研究人员利用光遗传学抑制非人灵长类动物的神经元放电并调控其行为铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建大体积组织照明装置。