脑片中通过喷射GABA诱导的全细胞电流

该喷射给药技术的总体目标是在全细胞膜片钳记录过程中进行药理学给药。该方法有助于解答电生理学领域中的一些关键问题，例如药物作用机制。该技术的主要优势在于，记录位点周围的药物浓度能够迅速升高，从而避免膜受体发生脱敏。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为急性前额叶皮层切片的制备以及喷射微管的位置相对难以掌握。开始此操作前，需将冷冻的切割液压碎成冰沙状。将这种冰沙状溶液置于冰上，并用95%氧气和5%二氧化碳持续通气。

接下来，将解剖好的头部放入盛有冰冻切割液的烧杯中，数秒后取出。用精细剪刀沿中线从尾侧向头侧方向剪开颅骨，并移除颅骨的两侧部分。然后，用精细刮勺取出脑组织，放入冰冻切割液中。

随后，将脑组织置于一个盛有冰块的九厘米培养皿盖上。用冰冷的切割液冲洗脑组织。然后，用剃须刀片切除小脑和嗅球。

随后，将氰基丙烯酸酯胶水涂抹在振动切片机的样品台表面。小心地将脑组织块放置在胶滴上，确保头端朝上，然后立即浸入冰浴的切割液中。调整刀片架与水平面成15度角。

将脑组织切成350微米的冠状切片。然后将切片转移至充满ACSF的恢复室中，在持续通入95%氧气和5%二氧化碳的条件下孵育一小时。在我们的实验中，急性前额叶皮层切片的制备也是该步骤中的关键环节。

健康的脑片意味着具有活性的神经元，能够实现紧密封接。在此操作中，制备玻璃硼硅酸盐微电极，用于记录电极或喷吹微电极。记录电极的尖端电阻范围为4至6兆欧，而喷吹微电极的尖端直径范围为2至5微米。

向ACSF中加入钠通道阻断剂以阻断快速钠通道，从而抑制动作电位，并在记录室中维持每分钟2至3毫升的恒定流速。持续用95%氧气和5%二氧化碳混合气体对ACSF通气，以确保脑片的存活能力。使用尖端经剪裁、大小适配脑片的巴斯德移液管，将脑片转移至记录室中。

接下来，在切片上方放置一个铂金切片锚，以将切片固定在平台上。然后，用内液填充记录用微电极，用浓度为 10 微摩尔、50 微摩尔和 100 微摩尔的 GABA 或作为溶剂对照的 ACSF 填充喷 puff 微电极。为防止碎屑堵塞，在将记录电极浸入 ACSF 之前，使用 1 毫升注射器施加轻微的正压。

在显微镜下，调整记录电极和喷射微移液管的位置，使它们的尖端位于显示器中央。然后，识别目标神经元。在逐渐降低喷射微移液管的同时调节显微镜焦距，将其以45度角置于记录神经元的上方。

将喷射微电极尖端与目标神经元之间的距离保持在20至40微米范围内。缓慢而小心地用记录电极接近神经元，然后释放正压。通过连接至电极夹持器的管路施加微弱且短暂的负压，以形成吉欧姆封接。

将电压维持在0毫伏。在形成吉欧姆封接后，手动或自动补偿快速和慢速电容。随后，通过管道施加短暂而强烈的负压，以进入全细胞记录模式。

随后，在电压钳制模式下记录诱发出的IPSC电流。通过由Master-8电压步进发生器控制的喷吹微电极，递送单次或成对的GABA喷吹。调整喷吹持续时间以获得最佳的诱发电流结果，并在脂多糖（LPS）诱导的抑制模型中测量诱发出的IPSC电流。

此处显示的是由 10、50 和 100 微摩尔 GABA 诱导的样本诱导性多能干细胞（IPSCs）。此处为喷 puff 持续时间反应曲线。在喷 puff 间隔分别为 1、2 或 3 秒的条件下，由 50 微摩尔 GABA 引发的重复性电流如图所示。

如果操作得当，掌握该技术后可在两小时内完成。在进行该步骤时，重要的是要始终注意获取健康的脑片。该技术建立后，为药理学给药领域的研究人员探索药物在电生理学中的作用效果奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分掌握在全细胞膜片钳记录中进行药理学给药的操作方法。请务必注意，河豚毒素（TTX）具有极高的危险性，操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套。