用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

本实验的总体目标是提高将肿瘤起始性肺癌细胞移植到小鼠气道中的效率。该方法有助于建立新的临床前模型，以回答癌症生物学中的关键问题，包括药物耐药性的成因以及肺纤维化与肺癌之间的关系。该技术的主要优势在于，它能够提高肿瘤起始细胞在多种小鼠品系肺组织中的移植效率。

该技术的意义延伸至治疗领域，因为它使我们能够模拟更多类型的人类肺癌亚型，而这些亚型对治疗具有不同的临床反应。在本方案中，首先需向小鼠注射博来霉素，然后在14天后注射肿瘤细胞。

两种注射的操作步骤非常相似，具体如下所述。注射前两小时，将博来霉素储备液置于冰上解冻，并稀释至工作浓度，之后保持在冰上。

对于细胞团注，需按照文本方案中所述准备好细胞悬液。每只小鼠的操作总时长约为10分钟。务必通过脚趾夹捏法确认麻醉效果，并在小鼠眼睛上涂抹兽医用眼膏。

此时，如果小鼠毛发颜色较深，则需将其腹部和背部的整个肋部区域剃毛，以便正确成像。然后，将小鼠固定在气管插管平台上，使其门齿钩住平台前端，背部紧贴平台。如果需要注射细胞团，应立即用轻柔吹打的方式重新悬浮细胞。

现在照亮胸部上部区域，打开口腔，并使用平头镊子轻轻拉出舌头。通过移除针头，准备用于气管的静脉导管，然后将其置于气管开口上方。接着，将导管插入气管，直至导管顶端接近门齿位置，并照亮导管内部以确认其位置正确。

然后，将50微升新配制的博来霉素或细胞悬液直接注入导管中。等待数秒，使全部液体流经导管。随后，取出导管并将其丢弃于10%次氯酸钠溶液中。

如果小鼠未吸入液体，请仔细观察其呼吸情况，并调整导管位置。若小鼠呼吸停止，应立即撤出导管，待其恢复呼吸后再重新插入导管。撤出导管后，继续操作，直至获得五只已处理、仍处于麻醉状态且 ready to image 的小鼠。

恢复期间，将小鼠仰卧置于经IACUC批准的加热垫上，并放入恢复笼中，持续监测直至其完全苏醒。注射细胞后两到三分钟，使用胰岛素针头经眼眶后途径注射100微升荧光素酶底物（luciferin）。每次成像时应交替使用另一只眼睛进行注射。

等待至少两分钟后，将最多五只小鼠以仰卧位放置于动物活体生物发光成像仪中，并使用发光设置采集背侧图像。在控制面板中调整分辨率和灵敏度设置，以检测细胞的发光强度。对于大多数应用，建议起始曝光时间为三分钟，像素合并（binning）设为中等，光圈值（f/stop）设为1，视野设为d，样本高度设为1.5。

如果注射成功，可在一只或两只肺的上胸部区域检测到信号。如果细胞聚集在气管入口处，则表明注射未成功。拍摄背部图像后，将小鼠翻转并采集腹侧图像，并根据需要调整设置。

成像完成后，按照文本方案中所述进行术后护理。随后，在移植后第3天重复该成像方案，并此后每周重复一次。图像分析使用生物发光分析软件。

首先，加载系列中的所有适当图像。本节内容针对一种特定的软件包进行详细说明。接下来，针对每只小鼠，在系列的第一幅图像中创建一个方形感兴趣区域，并将其置于胸部上部，覆盖整个肺部区域。

然后，通过右键单击，使用“复制所有感兴趣区域”功能，并利用此工具将相同的感兴趣区域应用到该组中的每张图像。接着，在每张图像内调整方框位置，使其覆盖每只小鼠的上胸部。对腹侧和背侧视图均执行此操作。

现在，在图像窗口的左上角选择光子函数，然后选择测量选项。感兴趣区域的数据将以总通量的形式显示在输出表格中。

根据需要分析这些数据。当免疫缺陷的裸鼠接受博来霉素处理后，在细胞团移植之前，博来霉素处理的小鼠在第14天观察到短暂的纤维化，而对照溶剂处理的小鼠则未观察到。

接下来，将已建立的人肺癌细胞系 H2030 的细胞经气管递送至这些小鼠的肺部。35 天后，博来霉素处理的小鼠肺部肿瘤负荷较高；而在对照溶剂处理的动物中，未检测到肿瘤。

通过组织学方法确认了肺部肿瘤负荷。经溶剂预处理的肺组织未见肿瘤结节，而经博来霉素预处理的肺组织则出现大肿瘤结节。移植转移性 H2030 BrM 3 细胞系后，在第 39 至 57 天时，生物发光强度过高，无法进行成像，因此对远处器官的转移情况进行了离体分析。

在多种组织中可检测到微小病灶，表明该方法在研究自发性播散性疾病方面具有潜力。掌握该技术后，每笼五只小鼠的操作时间约为10分钟（不含成像），若同时进行小鼠成像，则每笼约需20分钟。在实施该操作时，需特别注意确保导管正确插入，并密切监测动物的呼吸状况。

完成此操作后，可对收获的组织进行其他方法研究，例如药理学研究或氨基酸化学分析，以回答更多问题，如移植的肿瘤对药物的反应，或表征肺部特异性的肿瘤间质相互作用。该技术建立后，可应用于不同的小鼠品系和肿瘤模型，包括在生理相关环境下使用患者来源的异种移植模型。请注意，使用博来霉素可能具有极高危险性，在操作过程中必须采取预防措施，例如在生物危害柜中操作并妥善处理废弃物。