新生大鼠听觉脑干反应与外毛细胞全细胞膜片钳记录

本电生理检测方法的总体目标是研究耳蜗毛细胞在出生后发育过程中的形态和功能变化。该方法有助于解答听力辅助领域中的关键问题，例如：我们的毛细胞在听力开始时何时获得其功能？该技术的主要优势在于，我们能够评估从新生大鼠幼崽中分离出的单个外毛细胞的功能。

演示该实验操作的人员为本实验室的学生 Wenlu Pan、Shasha Guo 和 Nana Xu。开始此操作时，将麻醉后的动物置于聚乙烯泡沫模具中，以固定动物身体。随后，将动物放置于隔音室内的防震台上。

使用加热垫将动物的体温维持在37.5摄氏度。接着，用70%乙醇擦拭头部区域。在耳廓外侧腹外侧做一至二毫米的切口，用于放置参考电极或接地电极。

然后，将皮下记录电极放置在颅骨顶点上方。使用信号发生器产生经过校准的、不同频率和强度的短声脉冲。通过位于动物头部10厘米处的静电扬声器传递声音刺激。

为了获得听觉脑干反应，使用多功能处理器对声音诱发的电位进行滤波、放大和平均。40分钟的ABR记录通过在线监测并存储以供离线分析。在本步骤中，用70%乙醇喷洒动物头部进行消毒。

接下来，用剪刀沿矢状中线打开颅骨并取出脑组织，以暴露内耳。然后，将内耳转移至一个含有3毫升冰上预冷的Leibovitz's L-15培养基的35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，使用精细镊子去除耳蜗的骨性囊壳。

随后，将耳蜗神经节（OC）和螺旋神经节（SV）从蜗轴处松解。用镊子夹住SV的基部，从基部向顶端缓慢旋开，将OC与SV完全分离。接着，用精细剪刀将OC均匀地剪成三段。

所有步骤均应使用预冷的 L-15 溶液在冰上尽快完成，以最大限度减少降解和组织损伤。在此步骤中，使用 200 微升移液器吸头将耳蜗组织片段转移至载玻片上。加入 100 微升 4% 多聚甲醛，在 4°C 下固定至少 4 小时。

随后，用 100 微升新鲜 PBS 替换多聚甲醛以洗涤组织。然后，每次 10 分钟，共洗涤三次。之后，在室温下用含 0.3% 通透剂的 PBS 孵育组织 30 分钟。

30分钟后，弃去通透试剂，并用PBS洗涤组织三次。随后，在室温下用10%正常山羊血清和PBS封闭组织一小时。将组织在室温下与抗prestin C末端抗体及封闭液共同孵育两小时，或在4摄氏度下过夜孵育。

然后，用 PBS 洗涤组织三次，每次五分钟。随后，在避光条件下，将组织与含 Alexa 488 标记的二抗的封闭液在室温下孵育一小时。接着，在避光条件下，再用 PBS 洗涤组织三次，每次五分钟。

接着，在避光条件下，室温下用罗丹明-鬼笔环肽（rhodamine phalloidin）孵育组织10分钟。在避光条件下，用PBS洗涤组织三次，每次5分钟。然后，用封片剂将样本封固于载玻片上。

使用405纳米、488纳米和594纳米激光通过共聚焦显微镜进行成像。在此操作步骤中，使用拉针仪和微电极加工仪。制备尖端直径为2至3微米的膜片钳电极。

然后，用细胞内液重新填充移液管。使用 200 微升移液器吸头，将一块 OC 组织转移至 35 毫米的培养皿中。在室温下，用 100 微升酶消化液消化组织 5 分钟。

接着，用 100 微升 L-15 溶液替换酶消化液。使用显微手术刀将组织切成小块，以分离毛细胞。经轻柔吹打后，将细胞转移至自制的小型塑料腔室中，腔室内预先加入无酶的灌流溶液。

然后，将样品室置于倒置显微镜的载物台上，找到形态健康的单个外毛细胞。接着，将记录电极装入700B放大器的电极夹持器中。将记录电极移至外毛细胞底部周围位置。

随后，通过将细胞体侧壁密封，对毛细胞进行全细胞膜片钳记录。施加轻微负压，直至细胞膜破裂。然后，将钳制电位设定为 -70 毫伏。

膜电阻在10至17兆欧、膜电阻在100至500兆欧范围内的细胞被视为成功的全细胞构型。对细胞施加超极化和去极化电压以诱发全细胞电流。使用由膜片钳软件控制的双正弦波电压刺激方案测量外毛细胞（OHCs）的膜电容。

将刺激电压范围设置为140至110毫伏，并存储数据以供离线分析。经过轻柔消化后，从耳蜗组织（OC）中分离出外毛细胞（OHCs）。对从大鼠耳蜗急性分离的外毛细胞进行全细胞电压钳记录。此处展示的是从一只P9外毛细胞记录到的全细胞电流的代表性示例，该电流是在膜电位从140毫伏变化至107毫伏时产生的。

该图显示了从两个不同年龄的外毛细胞（OHC）获得的非线性膜电容。电容-电压反应曲线已拟合至Boltzmann函数。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。

完成此操作后，还可进行其他检测，如蛋白质印迹（Western blotting）和聚合酶链式反应（PCR），以回答更多问题，例如评估某些蛋白质（如毛细胞中的prestin）的表达水平。该技术建立后，为毛细胞领域研究人员探索耳蜗和前庭系统的电生理特性奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何研究耳蜗毛细胞在出生后发育过程中的形态学和功能变化。