一种用于测量肌营养不良小鼠模型行走能力的简单且低成本检测方法
2017年12月29日
本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场地活动实验中测量其行走能力的系统。我们证明，基于该系统的6分钟行走实验能够检测到mdx小鼠自主运动能力的下降，并能准确区分这些动物在肌肉特异性挽救后的功能改善。
本实验的总体目标是测量肌营养不良小鼠模型中的自主行走能力。该方法有助于回答肌营养不良研究领域中的关键问题，例如肌营养不良小鼠模型中肌肉无力的进展过程，以及潜在治疗手段的有效性。该技术的主要优势在于，它提供了一种非侵入性且可重复的动物活动度测量方法，可轻松适用于多种不同的研究环境。
在一天中固定的时间段内，于一个安静且温度受控的房间中，将摄像机放置在活动室上方的金属网架上，以确保能够完整记录整个活动区域；并使用消毒剂清洁活动室。在开始记录活动前，立即让小鼠抓住数字测力计的杆状把手，然后轻轻向后拉动，直至杆状把手被松开。记录每次试验中的最大拉力（单位：牛顿）。
每次试验之间休息一分钟。握力检测结束后，立即将小鼠放入实验箱中并开始录像，让小鼠自由探索。六分钟后停止录像，并将小鼠放回其居住笼中。
对于视频数据的追踪分析，首先在相应的视频编辑软件中打开录像，并将播放速度设置为两倍速。将降采样后的视频以 mp4 文件格式导出用于追踪分析，然后在相应的视频分析程序中打开该视频。为设置视频录制的校准参数，请使用线条工具沿培养室的一侧绘制一条直线。
右键单击线条，选择校准测量，并输入腔室边的实际尺寸（单位：厘米）。要开始对小鼠位置进行半自动追踪，请单击移动光标。从视频的初始帧开始，右键单击要追踪的点。
跟踪点将用一个蓝色圆圈标记。使用键盘上的右箭头键前进帧。跟踪点应根据尾部基部的位置自动移动。
如果在某一帧中追踪位置未与目标点对齐，请手动将蓝色圆圈对齐到追踪位置。当整个视频完成追踪后，保存视频和追踪轨迹图层，并选择“导出到电子表格”以导出轨迹的位置数据。与类似实验报道的结果一致，在测试前立即接受运动方案刺激的抗肌萎缩蛋白缺失的 mdx 小鼠，在六分钟开放场地实验中表现出的自主运动显著少于野生型动物。
事实上，在经历握力挑战这种轻度运动后，mdx 小鼠在自主活动实验的最初几分钟内通常保持静止，到第 4 至 5 分钟时活动量略有增加。然而，在未进行运动挑战的情况下比较野生型与 mdx 动物时，两者在移动距离上未检测到差异。表达乌托腓蛋白的转基因 mdx 小鼠与野生型动物无显著区别，在总移动距离或所观察的任何累积时间点上均无显著差异。
为了确定降低采样率的影响，测量了从一整分钟全帧率视频中得到的总移动距离，并将其与从该数据集降采样版本获得的距离测量值进行比较。将帧率降低一半后，测得的距离比原始计算的距离减少了5%。在此之后，测距的准确性急剧下降，尽管即使经过高度降采样的数据集仍能较好地近似动物的运动轨迹，这突显了在评估动物活动时考虑帧率和信号处理的重要性，同时也表明在降采样的视频数据中仍可保持较高的空间分辨率。
观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何在开放场地环境中记录和分析小鼠的自主活动。一旦熟练掌握，若操作得当，该分析可在 15 至 30 分钟内完成。这种低成本且非侵入性的检测方法使研究人员能够评估肌营养不良小鼠模型中的运动功能，并可作为进一步功能检测的有益初步步骤。
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概述
本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场地活动实验中测量其行走行为的系统。该方法可对动物活动进行无创且可重复的测量，并可适用于多种研究环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肌营养不良症研究
- 行为分析
背景
- 该检测方法用于测量肌营养不良小鼠模型的自主行走能力。
- 它可解答有关肌肉无力进展的关键问题。
- 该技术旨在评估潜在治疗手段的有效性。
- 记录在受控环境中进行，以确保结果的一致性。
研究目的
- 测量 mdx 小鼠的自主运动能力。
- 评估肌肉特异性干预措施的影响。
- 为肌营养不良症的进展提供见解。
使用的方法
- 使用位于活动室上方的摄像机进行记录。
- 试验前用消毒剂清洁活动室。
- 让小鼠抓紧一根杆状物以测量最大张力。
- 通过持续6分钟的自主活动实验记录行为数据。
主要结果
- 该系统可检测到 mdx 小鼠自主运动的减少。
- 它能准确区分因肌肉特异性挽救所带来功能改善。
- 不同实验间结果具有可重复性。
- 该方法可适用于多种研究环境。
结论
- 该检测方法适用于研究小鼠的肌肉营养不良症。
- 它可提供有关潜在治疗方法有效性的宝贵数据。
- 该方法具有灵活性，可在多种研究环境中应用。
常见问题
行业重要性概述
在小鼠模型中测量自主行走能力可为肌营养不良症的运动功能提供具有转化意义的读数，与临床终点（如6分钟步行试验）直接对应。这种低成本、基于视频的检测方法能够对疾病进展和治疗反应进行可重复、非侵入性的评估，适用于临床前研究。通过检测抗肌萎缩蛋白缺失的mdx小鼠的活动能力缺陷以及通过utrophin表达实现的功能恢复，该方法可支持神经肌肉疾病药物研发中的靶点验证和作用机制的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化杜氏肌营养不良模型中自主行走这一肌肉力量的功能性读数，验证治疗假设。
- 操作价值：通过在mdx小鼠与野生型及恢复型队列之间建立可重复的基因型-表型关联，实现生物学风险降低。
- 预测价值：通过区分能够使活动水平恢复正常至野生型水平的有效干预措施（例如，utrophin转基因），支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：利用标准化的开放场运动指标，准备经过验证的生物系统，用于后续化合物筛选。
- 可重复性：提供基于距离和时间的定量输出结果，适用于在不同实验室之间进行检测标准化。
- 可扩展性：依托免费的开源软件和易于获取的硬件，可在多种研究环境中重复使用该平台，无需依赖专用设备。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟与患者相关的行走功能缺陷，实现从发现到临床前验证的转化连续性。
- 机制性风险排除：明确观察到的作用效应是源于肌肉特异性功能恢复，还是源于非特异性的活动变化。
- 基于风险的决策：通过将行走功能恢复与靶点结合及通路调控相关联，为“继续/终止”决策提供依据。
流程与工作流整合
该检测适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，为肌营养不良模型中分子机制与表型结果之间提供功能性桥梁。
- 发现生物学：通过将遗传或药物干预与自主运动的可测量变化关联，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复的基于视频的追踪，实现检测就绪，生成可用于化合物评估的定量行走终点指标。
- 分析：生成位置和时间数据流，使研究团队能够比较不同基因型、处理方式和时间点之间的运动活动。
- 转化研究：通过模拟临床行走评估，连接临床前研究的连续性，促进生物标志物对齐和预测建模。
- 企业级复用：建立一种可复用、低成本的行走测试能力，减少对专业核心设施的依赖。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低运动功能检测中机制上的模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过开源追踪技术和受控的环境条件，增强实验的标准化和可重复性。
- 战略价值：在保持数据质量的同时，无需依赖昂贵的运动追踪系统，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于临床前模型中行走表型功能恢复的结果，支持进行风险调整后的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备视频录制和开源追踪软件操作的基本专业知识（例如，手动逐帧对齐）。
- 依赖标准成像设备以及稳定的环境控制条件（光照、温度、一天中的时间）。
- 需要各团队严格遵循统一的操作规程，以确保不同实验地点和操作人员之间的可重复性。
- 需根据不同的实验箱尺寸、小鼠品系和活动水平进行适应性调整。
- 在帧率与测量准确性之间存在权衡，因降低采样率会减少距离计算的精度。
