一种改进的小鼠麻醉状态下脑脊液采集方法

本实验的总体目标是改进从小鼠中采集脑脊液的方法，以避免血液污染。该方法提供了一种简便且可靠的脑脊液采集方式，可用于监测神经性疾病的相关生物标志物。该技术的主要优势在于，借助显微操作仪辅助从小鼠采集脑脊液，可显著减少采集过程中血液的污染。

首先，将拉制好的玻璃毛细管插入固定在显微操作仪上的毛细管夹持器中。接着，在体视显微镜下观察，使用直镊子折断尖端已拉细的毛细管，使其断裂后的尖端内径约为10至20微米。然后，将一根细管和一个注射器连接到毛细管夹持器的另一端，通过三通阀将细管与注射器连接，并将三通阀切换至开启状态。

然后快速推动注射器，排出任何污染物，并在毛细管中产生正压。通过将注射器与三通阀反复断开和连接，重复此操作数次。在最后一次将注射器重新连接至三通阀之前，吸入100至200微升空气。

将带有玻璃毛细管的显微操作仪移至一侧，以防止在手术过程中造成损坏。开始手术前，通过轻捏小鼠的四肢并观察其无反应来确认小鼠已完全麻醉。然后使用解剖剪从眼睛上方、两耳之间向后至颈部底部剪除并修剪小鼠头部背面的毛发。

使用立体定位仪的小鼠适配器固定小鼠头部。确保小鼠头部无法移动，并通过轻轻下压小鼠头部使其在适配器中牢固固定。使用剪刀和弯头镊子沿小鼠颈部后方剪开皮肤，然后沿两耳和两眼之间的颅骨中线向下剪开。

牵拉皮肤和组织，将其从枕大池区域移开。在解剖显微镜下观察，用镊子仔细剥离颅底覆盖的最后几层薄肌层，并将这些肌肉层移至一侧，远离目标区域。一旦暴露枕大池上的硬脑膜，使用湿润的棉签擦拭膜表面以清洁，然后用干燥的棉签将该区域擦干。

小脑延髓池呈三角形，有一至两条较大的血管穿过该区域。在血管的任一侧或血管之间进行毛细管插入和脑脊液采集最为理想。暴露小脑延髓池后，使用显微操作器将玻璃毛细管对准小鼠头部后方，使尖端刚好位于膜后方，角度为30至45度。

接下来，将注射器快速插入一次或数次，然后将活塞回拉 100 至 200 微升，以确保无污染物且玻璃毛细管内形成负压。随后将毛细管尖端缓慢靠近细胞膜，直至观察到阻力，但不得刺破膜。轻敲显微操作仪的控制装置，使毛细管轻轻震动并穿过细胞膜。

一旦刺破开口，脑脊液应自动流入毛细管中。将毛细管保持原位，以缓慢收集脑脊液。如果脑脊液停止流动，可缓慢回抽注射器约50 µL，以在毛细管内产生更大的负压。

在10至30分钟内收集10至15微升脑脊液。当收集到所需体积的脑脊液后，通过旋转三通阀使其关闭，并取下连接在管路上的注射器。打开然后关闭管路，以使毛细管、管路及毛细管外部区域的压力达到平衡。

然后，在显微操作仪上轻轻将玻璃毛细管从小鼠体内取出之前，重新连接注射器。接着，将含有1 µL 20X蛋白酶抑制剂的收集管置于玻璃毛细管的尖端下方。打开管路，缓慢推动注射器活塞。

脑脊液应从毛细管流出并进入收集管中。收集后，短暂离心脑脊液，使样本与收集管底部的蛋白酶抑制剂充分混匀。脑脊液样本可分装后于-80摄氏度保存，以备后续分析。

从12月龄APP/PS1小鼠收集的脑脊液中，人源Aβ42水平显著升高。在野生型小鼠中未检测到人源Aβ42。若操作熟练，该操作在正确执行的情况下可在一小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要注意在插入毛细管时避开血管，并且在收集脑脊液过程中仅使用显微操作器进行微小调整，以避免血液污染。