利用纠错型DNA和RNA测序进行稀有事件检测

该方法有助于回答多个研究领域中的一些关键问题，例如癌前克隆的检测、白血病患者治疗后的预后评估，以及骨髓捐献者中潜在致病性突变的鉴定。与我共同演示该实验流程的是 Spencer，他是本实验室的一名技术员。本视频介绍了如何将纠错测序方案与Illumina测序化学方法及市售基因检测 panel 相结合，以实现对克隆性单核苷酸变异及小片段插入缺失（indel）的检测，灵敏度可达万分之一（1 in 10,000）。

为了引入所需的唯一分子标识符，使用PCR方法制备定制的16N i5和i7接头。首先，配制Q5预混液，该预混液所用的聚合酶保真度高于 commercially available（商业可得）的替代品。然后，每项反应中加入37.5 µL Q5预混液、6 µL浓度为5 µM的16N i5接头（即唯一分子标识符）以及6 µL i7接头。

如果目标是多重测序，则在不同的样本中使用不同的i7接头。接下来，按照以下参数进行PCR扩增：98°C下30秒，随后进行4到6个循环，每个循环包括98°C下10秒、66°C下30秒和72°C下30秒。最后在72°C下延伸2分钟，并在4°C下保存。

然后，所需进行的PCR循环次数在很大程度上取决于所使用的基因面板的大小。根据我们的经验，如果基因面板包含约1500条不同的基因特异性寡核苷酸序列，则四轮PCR已足够；而若面板包含约500至600对寡核苷酸，则需要约六轮PCR。接下来，使用磁珠纯化PCR反应产物：向每份75 µL的PCR产物中加入56.25 µL磁珠溶液，然后将每个反应转移至单独的1.5 mL低吸附离心管中，用移液器反复吹打至少十次以充分混匀，并静置五分钟。随后，将混合物转移至磁力架上，静置两分钟使上清液澄清。

然后，移除并弃去上清液。接着，加入 200 µL 70% 乙醇，静置 30 秒，然后去除乙醇。重复此乙醇洗涤步骤一次，之后将磁珠在空气中干燥 5 分钟。

最后，用20 µL双蒸水从磁珠上洗脱修饰后的文库。然后将离心管置于磁力架上，使磁珠与洗脱液分离。首先，将上一步得到的ECS文库在PCR条板中进行10倍梯度稀释，依次稀释至原来的1/1,000。

接下来，在一个1.5毫升离心管中配制总反应混合液。每份反应体系中加入10微升ddPCR EvaGreen Mix、0.2微升P5引物、0.2微升P7引物以及4.6微升双蒸水。然后，将15微升EvaGreen总反应混合液移取至一组新的离心管中，最后向其中每管加入5微升经ECS纯化后的1至1,000倍稀释的产物。

接下来，使用液滴生成仪制备PCR液滴。首先，将卡盒装入仪器，向卡盒中标记为“oil”的孔中加入70微升液滴生成油，并向标记为“sample”的孔中加入20微升ddPCR反应混合液。然后，用橡胶垫片密封卡盒，将其放入液滴生成仪中，启动液滴生成程序。

现在，使用多通道移液器，在五秒内缓慢地将每个卡盒孔中取出的 45 微升液滴加样至新的 PCR 板中。然后，用铝箔密封 PCR 板。接下来，使用以下条件扩增液滴中的信号：95 °C 下 5 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 下 30 秒和 63 °C 下 1 分钟，然后将反应体系冷却至 4 °C 保持 5 分钟，再升温至 90 °C 保持 5 分钟，最后维持在 4 °C。

接下来，准备 ddPCR 模板液滴读取仪。选择绝对定量参数以及使用 QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 的选项，然后将反应样品上机进行液滴读取。

当 ddPCR 分析完成后，对每个样本应用相同的分割阈值。然后，将每个文库归一化至所需的分子数。首先制备 50 微升反应体系，其中包含 25 微升 Q5 预混液、2 微升 1 微摩尔的 P5 引物、2 微升 1 微摩尔的 P7 引物，以及 21 微升归一化后的 DNA 文库。

接下来，使用以下参数进行PCR扩增：98°C下30秒，随后进行16个循环，每个循环包括98°C下10秒、66°C下30秒和72°C下30秒，然后在72°C下延伸2分钟，最后在4°C下保存。接下来，测定文库中DNA的浓度，并将各文库按等摩尔量混合用于测序，目标浓度约为4纳摩尔。随后，使用Illumina测序平台对混合后的ECS文库进行测序，测序参数如下：双端144 bp读长，index 1进行8个循环，index 2进行16个循环。

一名GATA1基因突变患者的DNA在商业基因组DNA中稀释至原始VAF为0.19的水平。使用所述方案，ECS在单核苷酸变异检测中表现出高达1比10,000的定量能力。接下来，采用包含568个扩增子的商业测序 panel 对20名健康个体的血沉棕黄层样本进行了分析。

综上所述，在至少一个采集时间点的两个重复样本中均检测到109个克隆性体细胞突变，其变异等位基因分数范围为0.0003至0.1451。选取其中21个具有已知COSMIC注释的突变，并使用数字微滴PCR对每个突变进行验证。为展示该方案的纠错表达水平，采用了一个包含415个已知与多种癌症相关基因的定制化基因面板，构建了来自各基因最常表达外显子的文库。低丰度转录本的表达水平在重复样本间具有高度可重复性。

随后采用数字液滴PCR对六个表达水平不同的选定基因进行验证。比较结果显示，ECS方案能够准确捕获基因的表达水平，且无需进行归一化处理。掌握该技术后，可在一天半内顺利、从容地完成整个实验流程。

大部分时间为孵育过程，而手动操作约占所需总时间的30-40%，具体比例取决于研究人员同时处理的样本数量。在进行该实验流程时，为同一样本制备重复的测序文库至关重要。如果某一低频突变在两个重复样本中均独立地被检测到，则可更有把握地确认该突变为真实阳性结果。

采用此方法后，还可进行其他检测，例如ECS RNA分析，以回答低丰度转录本或融合转录本的检测等问题。该技术发展之后，主要为血液系统恶性肿瘤领域的研究人员提供了重要工具；我们利用该技术探索健康个体中的前白血病克隆，并检测处于缓解期的白血病患者的微小残留病灶。