利用伊文思蓝染料渗出实验（Miles实验）评估皮肤中诱导血管高通透性因子的作用

本实验的总体目标是测量小鼠真皮中由促通透性物质皮内注射所诱导的血管渗漏。该方法有助于回答有关体内血管通透性调控的关键问题，例如哪些分子能够刺激或抑制血管渗漏，以及参与其中的信号通路是什么。该方法的主要优势在于操作快速、相对简便，且主要使用常规实验室试剂和材料。

该技术的应用前景涉及病理性水肿相关疾病的治疗。特别是，研究人员可利用此检测方法快速、简便地识别新的分子靶点，并测试相关药物抑制血管通透性的能力。分别用0.9%生理盐水溶液配制组胺抑制剂马来酸吡拉明和伊文思蓝染料的溶液。

然后在超净工作台内操作，通过0.22微米滤膜过滤溶液以完成灭菌。将两种溶液分别装入带有30号针头的1毫升注射器中。接下来，固定小鼠颈部皮肤。

然后倾斜小鼠，使其头部朝向地面，腹部向上。将小鼠放置到位后，通过腹腔注射给予每克体重10微升的马来酸吡拉明溶液。接着，为促进血管扩张，将小鼠置于37摄氏度的加热室中10分钟。

然后将小鼠移至小鼠固定器中。接着用70%乙醇擦拭尾部，以进一步促进血管扩张。通过尾静脉静脉注射100 µL伊文思蓝染料溶液。

为防止出血，应迅速用手指和拇指夹住小鼠尾巴，并在注射部位施加压力。将伊文思蓝染料经尾静脉注射到小鼠体内是该实验流程中一项困难且关键的步骤。因此，在开展后续操作之前，研究人员必须熟练掌握此项注射技术。

建立操作熟练度需要事先练习。使用无菌的磷酸盐缓冲液稀释VEGF试剂，使给药的最终体积为20微升。然后将VEGF通透性诱导试剂和溶剂对照分别装入两支300微升、配有31号针头的注射器中。

保持针头与皮肤呈15度角，将20 µL VEGF皮内注射至小鼠侧腹部。观察皮肤内形成隆起的水疱，以确认注射成功。在另外两个相距至少1厘米的部位进行额外的皮内注射。

然后将小鼠翻转以暴露另一侧 flank，使用溶剂溶液重复进行三次注射。在纸上记录每个注射位点以及注射操作结束的时间。随后将小鼠转移回饲养笼中。

持续监测小鼠，直至其恢复意识并在笼内活动。在呼叫小鼠前，让VEGF溶液作用20分钟。在此阶段，按照相同的操作步骤，依次向所有小鼠注射VEGFA和对照溶剂。

20分钟后，将每只安乐死的小鼠仰卧位放置，并用大头针将其四肢固定在包裹了洁净纸巾的软木板上。接着，使用钝头剪刀从死鼠的下腹部至胸部做一条3到4厘米长的纵向切口。然后用镊子和手术刀从两侧腹壁分离皮肤。

使用手术刀去除渗漏部位周围存在的任何脂肪组织。然后使用镊子和手术刀切除渗出伊文思蓝染料的皮肤区域。所切除的皮肤区域必须大小相近。

将皮肤样本转移至1.5毫升离心管中，并做好相应标记。在通风橱中将管盖打开，置于加热块中过夜干燥。干燥完成后，在样本中加入250 µL去离子甲酰胺。

盖上管盖，并将其置于加热块中过夜，以提取伊文思蓝染料。将样品在台式离心机中以10,000 g或更高转速离心40分钟。离心结束后，在通风橱内操作，将每个离心样品中含有染料的上清液100微升转移至96孔板的孔中。

使用分光光度计读取伊文思蓝的吸光度。为了研究由VEGF诱导的血管渗漏，将50纳克VEGFA溶于磷酸盐缓冲液中，或仅使用磷酸盐缓冲液作为对照，注射到小鼠体内。图像显示，与对照组相比，注射VEGFA的皮肤样本中渗漏的伊文思蓝染料积累量增加。

此96孔板图像显示了从皮肤样本中用甲酰胺提取的伊文思蓝染料。该图展示了配对的VEGFA和仅载体对照样本的归一化吸光度值。结果显示，与仅使用载体相比，注射50纳克VEGFA显著增加了伊文思蓝染料的渗漏。

该图是在定量分析VEGFA样本与对照溶剂样本的光密度变化倍数后获得的。图中显示，与仅给予对照溶剂相比，给予VEGFA后血管渗漏平均增加了三倍。若操作熟练，该技术的主要步骤在正确执行的情况下可在两小时内完成。

在执行该操作过程中，重要的是将试剂诱导的血管渗漏与载体诱导的血管渗漏进行归一化处理，以消除非特异性血管渗漏及小鼠个体间的差异。该操作可与其他方法（如药物给药）相结合，以回答诸如某种蛋白是否可作为靶点用于抑制血管通透性等问题。该技术建立后，为血管生物学领域的研究人员探索基因修饰小鼠中血管高通透性的分子机制铺平了道路，并有助于鉴定介导血管渗漏所必需的关键信号组分。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在小鼠真皮中诱导并测量血管渗漏。