为分子与免疫组织化学分析制备发育中的外周嗅觉组织 果蝇

对果蝇物种中发育期瞳孔及成体外周嗅觉组织进行分期和解剖的总体目标是为外周嗅觉组织的分子与发育分析制备样品。该方法有助于回答嗅觉系统发育与进化领域中的关键问题，例如特定基因在外周嗅觉组织发育过程中的表达动态水平及其表达模式。通过该方法，我们可以深入了解果蝇物种中外周嗅觉系统的发育过程。

该方法也可应用于其他感觉系统，例如外周味觉系统和视觉系统。进行RNA测序实验时，应计划收集四个不同发育阶段的100至200个触角盘或触角。进行免疫组织化学实验时，应计划解剖10至20只果蝇。

使用70%乙醇清洁解剖过程中涉及的所有材料。然后，用RNase中和剂进一步清洁这些材料。所有溶液均需使用无核酸酶水或DEPC处理水配制。

为收集蛹，需每30分钟监测一次幼虫，并在零小时APF前蛹期收集蛹。此时幼虫将不再活动，并被一个非常浅色、近乎白色的蛹壳所包围。

在此阶段，将幼虫转移至含有湿润滤纸的小型两英寸培养皿中。若进行0小时APF阶段的解剖，应立即采集前蛹期的触角成虫盘；否则，用石蜡膜封住培养皿，并将样品置于25摄氏度条件下继续发育，直至达到目标发育阶段。

为了确定其他果蝇物种的蛹期发育阶段，需收集零小时的前蛹幼虫并将其分选至新的培养瓶中。然后记录从前蛹到成虫的天数，并将该时间按黑腹果蝇（melanogaster）的时间线进行比例换算即可。

首先，将150微升RNA提取溶液加入无RNase的1.5毫米离心管中并置于冰上预冷。接着，在解剖垫上分别滴加数滴PBS。将每只待解剖的蛹分别放入一滴PBS中。

对于0至2小时的蛹，使用镊子夹住口钩并拉动这些结构，以撕出并暴露脑组织和成虫盘。对于8小时的蛹，首先轻轻剥离蛹体最前端四分之一处的蛹壳，以暴露正在发育的头部，然后在颈部关节处将头部分离。

此时，触角原基已位于头部。接下来，将含有触角原基的组织转移至另一滴 PBS 中。随后，在视叶处识别与脑相连的眼-触角原基。

使用镊子将眼-触角原基分离，并转移至新的液滴中。在8小时的蛹中，眼原基包裹着触角原基，两者均位于脑的前方。在下一个液滴中，使用镊子将眼原基和触角原基分开。

然后使用P20移液枪头，轻轻吸取含有极少液体的解剖组织。将组织块放入RNA提取溶液试剂中，并继续解剖触角盘，直至收集至少100个。在蛹形成后约40小时，成体触角已形成最终形态，但仍呈透明状。

此阶段至少需要 50 个蛹前期个体用于 RNA 测序采集。首先准备 150 微升预冷的 RNA 提取溶液。在解剖垫上，将一个蛹放入一滴 PBS 中。

然后用一对镊子固定身体，从最前端的四分之一处轻轻剥离蛹壳，以暴露头部。接着，在颈部关节处小心移除头部。现在，将头部轻轻转移至一滴干净的PBS液滴中。

为了去除头部周围的膜，用移液器将头部在 PBS 中反复吹打。经过此清洗步骤后，触角应变得可见。现在在第二节与第三节之间的节间关节处，将触角与连接的膜分离。

第三部分包含触角嗅觉受体。然后使用移液器将解剖得到的组织轻柔转移至RNA分离溶液中，尽量减少随同转移的液体量。进行RNA提取时，应在成虫置于CO2垫上麻醉状态下进行解剖。

首先，用RNase抑制剂处理CO2垫和镊子。然后麻醉成虫，并在解剖显微镜下观察垫片。使用两把镊子固定虫体，轻轻拉出或夹出第三触角节，使其与第二触角节分离，以收集组织。

用镊子夹取触角，浸入RNA提取液中并释放。触角必须完全浸没在液体中。如果触角粘附在管壁上，RNA会提前降解。

收集到足够数量的触角后，继续进行RNA提取。或者将收集管长期保存在零下80摄氏度。如果触角用于免疫组织化学实验，则应在解剖垫上进行解剖操作，将果蝇浸没在含有或不含Triton的PBS溶液中。

分离的发育中嗅觉组织可用于RNA提取，随后进行RT-PCR以检测基因表达。例如，可通过此方法研究表面受体转录本和嗅觉受体转录本的表达。或者，也可利用这些组织进行免疫组织化学实验，以确定目标基因的表达模式及其在细胞内的定位。

例如，可以使用抗GFP和抗Laminin抗体对Rn-EGFP转基因果蝇进行染色。分析结果显示，在蛹形成后40小时，Or67d基因在触角的特定细胞中具有活性，通过GAL4-UAS系统驱动GFP的表达。一旦掌握操作技巧，若操作得当，解剖过程可在一小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记根据每种黑腹果蝇物种的蛹期发育时间框架，合理安排并准时进行挑选、培养和解剖。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如定量逆转录 PCR（qRT-PCR）、免疫组织化学染色，以及其他体内染色和转录谱分析技术，以回答有关发育组织中系统水平上的转录模式与表达谱的更多科学问题。该技术的建立将为研究感觉系统进化与发育领域的科研人员提供有力工具，推动其在果蝇物种的其他感觉系统中探索转录动态变化及新基因的发现。

请注意，使用尖锐的镊子、某些RNA提取溶液和甲醛可能具有极高的危险性。在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如事先练习解剖以培养精细的运动技能、保持高度专注力，并穿戴适当的实验服。