一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法
2018年8月25日
本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。
本视频的总体目标是介绍一种从成人皮肤组织中分离和培养原代人表皮细胞的新型简便方法。该先进技术更适合于为实验室和临床应用大量制备高潜能的表皮细胞。在称重前用PBS洗涤组织。
使用电子天平称量皮肤组织。用70%乙醇冲洗皮肤组织30秒。将组织在含抗生素的PBS中孵育，每次5分钟，共孵育两次。
将组织转移至另一个无菌培养皿中，使用手术刀片充分匀浆。每5分钟加入200微升PBS，以保持组织湿润。将匀浆后的组织转移至50毫升离心管中。
每1克皮肤组织加入10毫升酶混合液。将酶与匀浆后的组织充分混合。在37°C水浴中振荡孵育该混合物。
随后，加入体积为原液1/5的0.25%胰蛋白酶。在37°C水浴中继续孵育30分钟。按1:100的比例向混合物中加入DNase I溶液。
然后继续孵育五分钟。加入等体积的中和培养基以终止消化过程。用移液器将溶液上下吹打约20次。
将解离的细胞通过100微米细胞滤筛过滤，以去除组织碎片。在200 g条件下离心五分钟。观察试管底部的沉淀物。
移去上清液，并用10毫升中和培养基洗涤细胞沉淀。然后在200 ×g下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含有10 µM ROCK抑制剂的接种培养基中。
在100毫米培养皿中接种2×10⁶个细胞。三天后，将接种培养基更换为无血清角质形成细胞培养基。每两天更换一次培养基。
当细胞密度达到约80%时，进行传代。用PBS洗涤细胞。如有必要，用胰蛋白酶消化两分钟，并用PBS洗涤细胞以去除污染的真皮细胞。
加入等体积的中和培养基。在200 g条件下离心5分钟。最后，弃去上清液并重悬细胞沉淀。
从人皮肤组织中分离的角质形成细胞采用两种方法分别进行培养。传统方法为两步消化法，需进行为期两天的操作；相比之下，新方法为一步消化法，操作时间约为三小时。
在第三天，使用新方法培养可观察到大量细胞簇，而采用传统方法则不会出现此现象。第五天时，观察到新方法产生的原代细胞数量更多。为检测培养的角质形成细胞的分化状态，我们分析了基底细胞标志物K5和终末分化标志物Loricrin。
我们发现，第3代培养时90%的总细胞呈K5阳性，但表达兜甲蛋白（Loricrin）的细胞不到10%，表明这些细胞为未分化的角质形成细胞。我们检测了真皮成纤维细胞中表达的波形蛋白（vimentin），以评估分离过程中是否存在真皮细胞污染。结果显示，初始代次中约有3%的真皮细胞存在，但在第3代培养中仅检测到约0.02%的真皮细胞，表明经过传代后表皮细胞纯度较高。
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概述
本文介绍了一种从成人皮肤组织中分离原代人角质形成细胞的简化方案。该方法利用ROCK抑制剂Y-27632促进表皮细胞与真皮细胞的分离。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 皮肤科学
- 再生医学
背景
- 原代人角质形成细胞对于多种研究应用至关重要。
- 传统的分离方法可能复杂且耗时。
- 使用ROCK抑制剂Y-27632提供了一种更高效的方案。
- 分离得到的角质形成细胞可用于实验室和临床环境。
研究目的
- 建立一种更高效的表皮细胞分离方法。
- 提高高潜能表皮细胞的得率。
- 促进涉及皮肤细胞的研究与临床应用。
使用的方法
- 称重前用 PBS 清洗皮肤组织。
- 使用电子天平称量皮肤组织。
- 用 70% 乙醇冲洗组织 30 秒。
- 将组织在含抗生素的 PBS 中孵育，每次 5 分钟，共孵育两次。
主要结果
- 该方案可成功分离原代角质形成细胞。
- 获得了高产量的活表皮细胞。
- 该方法具有可重复性和高效性。
- 所分离的细胞可用于多种应用。
结论
- 该方法简化了原代角质形成细胞的分离过程。
- 它为该领域的研究人员提供了一种可靠的实验方案。
- ROCK抑制剂的使用可提高细胞得率和存活率。
常见问题
行业应用价值
从成人皮肤中分离高纯度的原代人角质形成细胞由于得率低和污染风险，仍然是皮肤病学和再生医学研发中的一个瓶颈。本简化的一步酶解法结合ROCK抑制剂Y-27632，可提高表皮细胞的回收率和干性，实现靶点验证和临床前建模所需的规模化生产。该方法降低了操作复杂性和耗时，有助于从发现到先导优化阶段的可重复检测开发和转化研究的连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在生理相关的原代人类细胞系统中研究表皮信号通路及靶点结合情况。
- 操作价值：提供可再生的高纯度原代角质形成细胞（K5+/Loricrin-），实现稳定可靠的靶点去风险化研究。
- 预测价值：通过维持干细胞特性及极低的成纤维细胞污染（P3代时<0.02%），支持基于机制的靶点去风险化，实现可重复的表型筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪： 可生成大量具有活性的表皮细胞，适用于高通量化合物筛选和细胞毒性检测。
- 标准化： 一步消化法（约3小时）提高了不同批次及不同实验室间实验结果的可重复性。
- 可扩展性： 无需分离表皮与真皮，可应用于多种成体组织，提高先导化合物筛选工作的通量。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：产生具有干细胞特性的角质形成细胞，可模拟人类表皮稳态和屏障功能。
- 转化连续性：在传代过程中保持表型稳定性，支持临床前疗效和安全性测试。
- 风险调整后的推进：高纯度和高产量降低了生物学变异性，提高了对局部用药或再生疗法候选药物“推进/终止”决策的信心。
流程与工作流整合
该方法通过提供经过验证的原代人角质形成细胞，用于早期靶点验证，推动筛选项目的检测方法开发，并支持皮肤治疗药物的临床前评估，从而契合发现研究的连续进程。
- 发现生物学：利用纯化且富含干细胞的人源细胞系统，促进针对表皮靶点的假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的细胞制备方案，用于化合物评价中的剂量反应和生物标志物检测。
- 分析：可检测分化标志物（K5、Loricrin）和污染水平（波形蛋白），以评估细胞表型和纯度。
- 转化研究：通过维持表皮干细胞特性与功能，支持从分离的原代细胞到临床前模型的连续性研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的细胞分离平台，适用于所有需要人源表皮细胞的多个项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过高纯度、富集干细胞的角质形成细胞生产，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：将分离时间从两天缩短至约3小时，提升实验室通量和资源利用效率。
- 战略价值：通过减少真皮污染带来的生物学噪声，增强早期研究项目的预测可信度。
- 项目组合影响：基于可靠的表皮细胞检测方法，实现候选分子的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞培养和酶解组织分离技术的专业知识。
- 需要获取ROCK抑制剂Y-27632、酶混合物（如dispase、胰蛋白酶）以及DNase I用于消化处理。
- 需要标准化的离心、过滤和无菌操作技术，以维持细胞活力和纯度。
- 需要调整接种和角质形成细胞培养基配方，以实现最佳扩增和传代效果。
- 实际限制因素包括皮肤组织质量的供体差异，以及需要无菌操作以防止微生物污染。
