乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

该方法有助于解答自噬领域中的关键问题，例如自噬体形成是如何被调控的，以及各种细胞处理和条件如何影响整体自噬。该技术的主要优势在于其能够检测内源性货物的封存过程。因此，该方法具有广泛的适用性，且不依赖于人工过表达或外源性货物探针的引入。

演示该实验步骤的是来自我实验室的博士生 Paula Szalai 和 Morten Luhr。首先，在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中，将贴壁细胞接种于75平方厘米的组织培养瓶中进行培养。待细胞生长至接近汇合的单层状态。

此后，用 3 毫升 pH 7.4、37 摄氏度的 PBS 洗涤细胞。移除 PBS，并加入 3 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。在含 5% 二氧化碳、37 摄氏度的湿化培养箱中孵育，直至细胞脱落。

接下来，将细胞重悬于7 mL含10% FBS的培养基中，并转移至无菌的50 mL离心管。使用0.5至20 µL移液器吸头，取10 µL细胞悬液加入含有10 µL台盼蓝的微量离心管中。使用同一吸头立即加样至细胞计数板，然后在自动细胞计数仪中进行细胞计数。

然后使用含有10%胎牛血清（FBS）的培养基制备适当稀释度的细胞悬液。采用无菌技术，将1毫升稀释后的细胞悬液接种至12孔组织培养板的每个孔中。置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育，直至达到所需细胞密度。

根据所需的实验处理，留出一组孔不进行处理，以确定可沉淀LDH的本底水平。在收获前3至4小时，向每孔加入足量的胞内分选抑制剂Bafilomycin A1。在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。

在处理期结束时，吸弃培养基。向每孔加入200微升预热至37摄氏度的细胞解离液。在37摄氏度孵育，直至细胞脱落。

向每个孔中加入500 µL pH 7.4、含2% BSA的室温PBS。使用移液器吹打混匀，直至无可见细胞团块。随后立即将每个孔中的细胞悬液转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上。

将离心管在400 × g、4°C条件下离心5分钟，以沉淀细胞。用吸液装置彻底吸除上清液，尽量使细胞沉淀保持干燥。然后，向每根离心管中加入400 µL含有10%蔗糖的超纯水溶液。

使用移液器重悬细胞沉淀，以获得接近单细胞的悬浮液。将该悬浮液转移至4毫米电穿孔比色皿中。将比色皿放入指数衰减波电穿孔仪中，并施加一次800伏、25微法、400欧姆的电脉冲。

使用新的移液枪头将细胞裂解物转移至含有 400 微升预冷的磷酸盐缓冲蔗糖溶液的 1.5 毫升微量离心管中，并通过移液操作短暂混匀。对每个样品重复此重悬、电穿孔裂解和混匀过程。若首次进行该操作，请务必按照文中所述方法验证细胞质膜电穿孔裂解的效率与特异性。

为获得沉淀的LDH组分，从每份稀释后的细胞裂解液中取出550微升，转移至各自含有900微升冰上预冷的重悬缓冲液（含0.5% BSA和0.01% Tween 20）的2毫升微量离心管中。轻轻吹打混匀。在4°C、18,000 × g条件下离心45分钟，以获得含有沉淀LDH的沉淀物。

通过抽吸，彻底吸除上清液，使沉淀尽可能干燥。将沉淀的LDH样品在-80摄氏度下保存，直至准备分析。对于总LDH组分，从每份稀释的细胞裂解液中转移150微升至各自新的离心管中。

将这些样品保存在-80摄氏度冰箱中，直至准备进行分析。将沉淀的LDH和总LDH样品置于冰上解冻。解冻后，在总LDH样品中加入300微升含1.5% Triton X-405的冰上预冷重悬缓冲液。

将样品置于冷室中，在滚转仪上旋转孵育30分钟。随后，向已沉淀的LDH样品中加入750 µL含1% Triton X-405的预冷重悬缓冲液。使用移液器吹打，使沉淀完全重悬，直至溶液均匀。

将所有样品在 18,000 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟，以沉淀未溶解的细胞碎片。离心完成后，将样品置于冰上。使用文中所述的经典酶法测定或任何 commercially available 试剂盒测定上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）水平。

本研究中，在多种不同的哺乳动物细胞系中监测了整体自噬捕获活性。如图所示，非依赖性和饥饿诱导的LDH捕获以及LNCaP细胞均被广谱PI3激酶抑制剂3MA完全抑制。选择性III类PI3激酶抑制剂SAR-405和内质网钙泵抑制剂Thapsigargin也表现出类似效果。

在饥饿条件下，HEK293细胞中LDH的隔离作用被毒胡萝卜素（Thapsigargin）和ULK抑制剂MRT 67307显著减弱。此外，在其他观察的细胞系中，3MA consistently 抑制饥饿诱导的LDH隔离作用。接下来，利用多种ATG基因敲除的MEF细胞，检测报道中对自噬体形成至关重要的自噬相关基因是否也参与LDH隔离过程。

可以看出，在ATG5基因敲除的MEF细胞中，饥饿诱导的LDH聚集现象消失。此外，在ATG7和ATG9A基因敲除的MEF细胞中，该现象也明显减弱。最后，还检测了RNA干扰介导的关键ATG基因转录本沉默所产生的效应。

转染靶向ATG9A的siRNA或同时靶向ULK1和ULK2的siRNA可显著降低LNCaP细胞中LDH的包封。在进行该操作时，所有移液步骤均需精确。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如长寿命蛋白降解实验），以回答更多问题，例如：包封活性的变化是否导致自噬降解活性出现相应改变？

在哺乳动物细胞系中建立该方法后，我们利用该方法证明了巨自噬不依赖于LC3蛋白家族，而是需要GABARAP家族蛋白。这凸显了采用不依赖LC3的方法来监测自噬活性的重要性。