利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

该方法有助于解答自然杀伤细胞（NK细胞）生物学领域中的关键问题，即调控效应细胞功能的特定基因和信号通路的作用与功能。该技术的主要优势在于，与依赖DNA的方法相比，其成功率更高，能够高效敲除NK细胞治疗中最具临床相关性的基因之一。该技术的应用前景涵盖表达TGF-β作为免疫逃逸机制的实体瘤和脑瘤的免疫治疗。

对于原代NK细胞的转导，将每毫升RPMI培养基中含5×10⁵个 freshly isolated NK细胞的悬液，按每T75培养瓶加入适量体积，在含100 IU/mL IL2的条件下培养4天，每隔一天更换培养基，并在转导前一天换液。对于扩增后的NK细胞转导，在第0天以1:1的比例用经辐射处理的表达膜结合型IL21的K562饲养细胞刺激原代NK细胞，每隔一天更换培养基，并在转导前一天换液。在电穿孔当天，为每个实验组的细胞条件准备一个T25培养瓶，加入8 mL新鲜培养基（每毫升含100 IU IL2），并将培养瓶置于37°C、5% CO₂、湿度充足的培养箱中。

在培养基平衡的同时，将每种条件下的三至四乘以十的六次方个细胞加入26微升转导混合液中，置于锥形管内，通过离心形成细胞沉淀。随后，每次用12毫升无菌PBS洗涤细胞三次，每次洗涤均需去除细胞悬液中的全部FBS。在洗涤细胞的同时，将每种CRISPR RNA和tracrRNA重悬至200微摩尔的终浓度。

将每个样本的2.2 µL CRISPR RNA与一剂200 µmol的tracrRNA混合，于95 °C加热5分钟。随后让样本冷却至室温，并将CRISPR RNA/tracrRNA复合物保存在-20 °C，直至使用。为形成核糖核蛋白复合物，将Cas9核酸内切酶加入相应的CRISPR RNA/tracrRNA复合物中，轻柔涡旋混匀30至60秒，然后在室温下孵育生成的Cas9核糖核蛋白复合物15至20分钟。

最后一次洗涤后，加入P3核转染试剂盒中的全部电穿孔补充液体积，将每个细胞沉淀重悬于20微升P3原代4D-核转染溶液中，注意避免产生气泡。立即向每种细胞悬液中加入5微升相应的核糖核蛋白复合物，并向Cas9核糖核蛋白复合物细胞混合液中加入1微升100微摩尔的Cas9电穿孔增强剂。将26微升Cas9核糖核蛋白细胞溶液转移至Nucleocuvette电转杯条的各个孔中，并轻轻敲击电转杯条，确保样品覆盖每个孔的底部。

然后启动 4D-Nucleofector 系统的 EN138 程序。转导结束后，让细胞静置三分钟。随后向每个比色皿中加入 80 µL 预先平衡的培养基，并将样品轻柔地转移至各自条件对应的培养瓶中，在 37 °C 条件下孵育。

培养48小时后，根据标准操作流程，从5 × 10⁵个转导细胞中提取基因组DNA，用于基因敲除筛选。随后，以1:1的比例，用新鲜的表达膜结合型IL21的饲养细胞刺激其余转导细胞，并在共培养5天后，根据标准操作流程提取RNA，用于通过定量PCR进行基因表达分析。流式细胞术分析显示，在现有的Nucleofector系统程序中，EN138程序可获得最高的细胞活力百分比和转导效率。

例如，使用商业化提供的向导RNA，可在扩增的人自然杀伤细胞中成功敲除人HPRT1基因。此外，包含向导RNA2、向导RNA1加向导RNA2以及向导RNA3的Cas9核糖核蛋白均能成功敲除TGF-β受体II的胞外域基因，而单独使用向导RNA1则未诱导出任何T7E1可检测的插入缺失突变。事实上，使用EN138程序进行Cas9核糖核蛋白电穿孔，可使经该程序转导的细胞中TGF-β受体II mRNA表达水平降低60%。

此外，将转导细胞与TGF-β及一种人原代髓母细胞瘤细胞系共培养后，NK细胞的细胞毒性与未经TGF-β处理的对照转导细胞相比无显著差异，这表明Cas9核糖核蛋白修饰细胞在蛋白水平上TGF-β受体II功能相应缺失。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行该实验时，需注意设计多种不同的向导RNA，以获得最佳的基因编辑效果。

完成此操作后，可进一步采用DNA测序或T7E1突变检测等方法，以回答有关基因编辑效率的问题，或确定潜在的脱靶遗传突变。该技术自建立以来，为癌症免疫治疗领域的研究人员探索利用基因编辑的NK细胞进行癌症治疗的潜力铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对原代人源NK细胞进行基因编辑。

有关此过程后自然杀伤细胞扩增的更多信息，请参见我们早前在 JoVE 上发表的文章。请注意，处理人血具有极高的危险性，在进行本操作时应始终采取通用的健康与安全防护措施。