一步式冷大气等离子体处理诱导神经干细胞分化 体外

该方法有望增强神经干细胞的体外分化，并为帕金森病等神经系统疾病的治疗提供支持。该技术的主要优势在于，冷大气等离子体可一步式安全地诱导神经干细胞定向分化，适用于组织移植。冷大气等离子体可在较短的处理时间内促进神经干细胞的分化。

随着对细胞的损伤增加，可获得用于移植的理想细胞。首先，在25平方厘米的培养瓶中接种约5×10⁵个鼠源性神经干细胞，在37°C、5%二氧化碳条件下，加入5毫升完全DMEM培养基培养2至3天。

当细胞达到85%融合度时，用一毫升PBS洗涤培养物。处理前，加入一毫升25%胰蛋白酶作用一分钟。当细胞脱落时，加入一毫升培养基终止反应。

反复吹打数次，制成单细胞悬液。计数后，将细胞稀释至每毫升2×10⁴个细胞的浓度。在12孔细胞培养板的9个孔中，每孔接种1毫升干细胞至一片预先用多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。

在显微镜下检查细胞密度，并将细胞放回培养箱中孵育12小时。待细胞贴壁后，用1毫升PBS洗涤盖玻片两次，每次洗涤使用1毫升PBS，然后用分化培养基处理细胞48小时。

进行射流采集时，首先将电源的输出线连接至等离子体射流装置，再将高压探针的探头与输出线连接以检测电压。然后将高压探针的另一端连接至示波器，以记录输出电压的信息。

检查整个电路，确保电源、示波器和高压探头均已接地。检查气路，确保气体管路已连接至等离子体射流装置。接下来，打开氦气和氧气的气阀，并将气体流量调节为氦气与氧气以1升/分钟比0.1升/分钟的比例通入。

再次检查电路，然后按下输出按钮以产生等离子体射流。对神经干细胞进行等离子体处理时，将注射器喷嘴与第一孔细胞之间的距离设置为15毫米。将神经干细胞培养物中的上清液更换为800微升新鲜分化培养基。

将培养板置于等离子体射流下方，确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心位置。每孔分别用等离子体处理60秒，制备三个孔；另用1%氦气和氧气混合气体处理60秒，制备三个孔。

留出三个孔不进行处理，作为空白对照。然后将上清液更换为一毫升新鲜的分化培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养六天。

每天在倒置相差显微镜下观察各组细胞的分化状态。处理后，将细胞在条件培养基中充分平衡约一小时，然后用新鲜的分化培养基更换上清液。进行免疫荧光分析时，在室温下用每孔500微升的4%多聚甲醛固定细胞，作用20分钟。

随后用 PBS 缓冲液轻轻漂洗三次，每次加入一毫升 PBS，每次漂洗五分钟。接着在室温下用含 2% Triton X-100 的 PBS 溶液对固定后的样本进行 10 分钟的通透处理。之后按照示范进行轻柔漂洗。

最后一次洗涤后，每份样品加入一毫升含10%胎牛血清的PBS溶液，在室温下封闭非特异性结合位点，孵育一小时。孵育结束后，每孔加入300微升目标一抗溶液，在4摄氏度下避光孵育过夜。随后按前述方法用PBS洗涤三次。

最后一次洗涤后，每孔加入 300 微升适当的二抗对细胞进行标记，在室温下避光孵育 2 小时。然后每孔加入 1 毫升 PBS，室温下轻轻漂洗 10 分钟。

使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察细胞。与未经处理的对照组及气体流处理的干细胞相比，经等离子体处理的神经干细胞表现出更快的分化速率和更高的分化比例。等离子体处理后，Nestin 表达减少。

Beta-Tubulin III 显著增加，与对照组处理和气体流动处理的干细胞相比，O4 略有增加。此外，经过 60 秒的等离子体处理后，可观察到成熟神经元、胆碱能神经元和运动神经元标志物的强烈表达。

仅有极少数的GABA能和5-羟色胺能神经元，且未检测到多巴胺能神经元。在进行这些操作时，务必注意以适当的等离子体剂量处理细胞，因为长时间且高强度的等离子体处理会诱导细胞发生凋亡或坏死。同时请记得在后续应用前预先检测细胞活力。