新生啮齿类动物脑干-脊髓节律性活动体外制备及薄片制备

该方法可实现对啮齿类动物脑干的可重复性分离与切片，用于捕获分析弥散性延髓呼吸网络。该技术具有高度的实验灵活性，可制备离体延髓块或脑片标本用于记录。该方法可用于电生理学实验，以探究产生呼吸节律的神经调控回路，并研究基因修饰啮齿类动物中呼吸功能的病理机制及调节异常。

解剖神经轴后，迅速将分离出的动物躯干转移至解剖显微镜下的充氧解剖皿中，将组织背侧朝上放置，头端朝向解剖皿前方。用固定针在肩部及脊髓最尾端处固定组织，沿顶骨缝在颅骨上做正中矢状切口，以避免损伤颅骨下方的大脑皮层和脑干。从矢状缝开始，向两侧剪开枕骨缝，形成骨瓣，将其翻折并用针固定，以锚定和稳定颅骨的头端部分。

将两侧颅骨瓣翻折后，切除其余的大脑皮层，保留小脑后部相对完整，以便进行背侧椎板切除术。使用微型弹簧剪和镊子去除颅骨及脊柱周围的肌肉组织。去除肋笼背侧的组织，保留肋骨完整，并小心剪除外侧的椎弓突起。

切除覆盖在脑桥和延髓上方的所有组织后，小脑蚓部、小脑、脑桥以及脊髓起始部分将清晰可见。进行腹侧椎板切除时，将组织背侧朝下放置，并在肋骨和脊柱最尾端处用针固定。利用颅骨瓣将组织的头端固定住，随后去除肋骨的腹侧一半，包括胸骨及所有腹腔器官。

剥离附着在肋骨上的软组织，以暴露肋骨和脊髓，并移除舌、食管、气管、喉以及覆盖在颅底和脊柱上方的所有其他软组织和肌肉。为辨认硬腭，请解剖覆盖在颅底这块矩形骨板上的组织，该骨板包含一个V形凹陷。然后沿硬腭中线切开，小心向上提起组织，并进行横向切割以将其移除。

开始腹侧椎板切除术时，先去除椎板，暴露从第一颈椎至大约第七胸椎水平的脑干腹侧表面及脊髓。沿椎板两侧的脊柱剪开5至10毫米。当脊髓暴露后，沿脊柱向大约T7水平，在两侧各剪断约20至25毫米长的根丝。用钩状或弯头镊子小心提起C1、C2和C3的头侧边缘，以便在骨下方进行剪切，从而移除这三个椎骨。当所需长度的脊髓已从椎管中分离后，进行横向切断，以取下脊髓组织。

去除硬脑膜后，将脑干置于塑料切块上石蜡平台的中央，使用长度不超过一厘米的细昆虫针，从脑干尾端经远端脊髓将其固定。然后将带有固定脑干的石蜡包埋切块对准振动切片机（Vibratome）切块架，使刀片切割方向垂直于脑干的头端表面。接下来，先进行一次初步切片，去除组织最前端200至300微米的不平整多余组织，并根据需要进行微调，以确保PARP线性对齐，并进行小范围修切以去除任何不平整的组织。

舌咽神经根丝将在脑干的外侧边缘变得可见，从这些吻侧神经解剖标志处切取一块300至500微米厚的脑干组织，以包含前包钦格复合体及其相关传导通路。切片过程中的所有步骤对于制备出可重复且具有活性的脑片至关重要，必须确保所有必要的神经环路结构处于正确方向，以产生稳定的节律。采用此方法可在薄切片中完整保留生成和传递吸气节律所必需的最简神经环路元件。

包括前包钦格复合体、投射至舌下神经运动神经元的前运动神经元以及舌下神经根丝。前包钦格复合体、舌下神经（第12对脑神经）根丝和C4神经根丝可用于记录吸气相活动。该操作的关键在于仔细分离根丝，并在切出最后一片脑片前确认脑干未受损伤。

采用此方案后，可使用膜片钳技术、细胞外记录或吸电极来记录神经网络产生的电活动。以往发表的实验方案很少提供详细的逐步操作说明，导致新研究人员难以直接应用该方法，往往需要前往其他实验室，跟随经验丰富的研究人员学习一段时间才能掌握。