通过光激活型尼古丁的激光闪光光解法探查小鼠脑片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

该技术利用多光子激光扫描显微镜结合光激活型尼古丁分子的激光闪光光解，实现对烟碱型胆碱能受体的精确激活。该方法可在时空上精细控制烟碱型受体激动剂的应用，为研究受体功能表达模式以及胆碱能突触传递或容积传递提供了强有力的工具。

开始实验前，使用可编程的拉针仪将玻璃微电极拉制成直径为20至40微米的开口。将约一毫升记录液通过0.22微米滤膜过滤。然后将足量的冻干型光激活尼古丁溶解于过滤后的记录液中，使其终浓度为2毫摩尔。

用50微升光激活药物回填已拉制的局部给药微移液管，并将移液管固定在安装于显微操作仪的移液管架上。通过适当长度的管路将移液管架连接至可维持低压力持续给药的压力喷射系统。使用显微操作仪将局部给药移液管移入细胞外记录液中。

将移液管尖端置于小鼠脑组织样本上方约50微米处，靠近目标细胞。短暂施加1至2磅每平方英寸的压力至移液管。目标细胞应几乎无位移或完全无位移。

在建立稳定的全细胞膜片钳记录后，打开压力喷射装置的低压力模式，用光激活型尼古丁对细胞周围组织灌注 1 至 2 分钟，使其充分饱和。局部给药会增加实验的复杂性，但可节省化合物用量，并允许使用更高浓度的光激活型尼古丁（PA-Nic）。

对于光激活型尼古丁的浴式给药，首先将足量的冻干药物溶解于适量的记录液中，配制成终浓度为100微摩尔的溶液，并将其加入灌流系统。然后以每分钟1.5至2毫米的流速开始循环灌注光激活型尼古丁溶液，使用内径最小且总长度最短的管路，以尽量减少所需的循环体积。

在循环过程中，持续用碳氧混合气体（carbogen）鼓泡通入溶液，并在弱光条件下将浴液温度维持在32摄氏度。浴式给药具有操作简便且光敏尼古丁（PA-Nic）在组织中渗透均匀的优点，但必须使用较低的微摩尔浓度PA-Nic，且会消耗更多的化合物总量。

为了实时观察内侧缰核神经元，使用透射光或红外微分干涉差光学系统，并结合视频摄像机建立稳定的全细胞膜片钳记录。在形成高阻封接的细胞贴附构型后，但在破膜之前，将装置和软件切换至激光扫描模式。破膜后，利用激光扫描确认目标成像染料是否通过扩散被动填充神经元。

在使用活体扫描功能观察目标神经元及亚细胞结构之前，让染料至少填充细胞区室 20 至 30 分钟。选择合适的成像参数，以准确地实时显示神经元特征，并根据需要调节相应设置，以调整显示效果、分辨率、信噪比和图像帧采集时间。为增强信号对比度，打开查找表窗口，并调节查找表的下限（floor）和上限（ceiling）设置。

为了在组织中定位感兴趣的区域，选择1倍光学变焦，并使用平移控件。使用Z系列工具选择包含目标细胞的起始和终止位置。设置步长为1微米，并选择能够获得最高分辨率图像的图像尺寸。

通常每行 1,024 × 1,024 像素。随后连续对包含细胞的每一个 Z 平面中的神经元进行成像。为校准激光刺激，启动系统扫描，使用高于最低功率的成像激光功率，并微调物镜焦点至薄红色标记荧光层。

选择荧光视野中无碎片且标记物覆盖均匀的区域，打开工具、校准与对齐菜单，选择解笼galvocalibration功能。按照烧蚀斑点教程对第二对振镜进行空间校准，选择405纳米激光，激光刺激功率设为400，刺激持续时间为20毫秒，以在红色标记物上形成直径为1至5微米的孔洞。

选择“更新”以在中心点烧蚀后激发并刷新图像，并将圆形红色指示器移至中心、右中和下中位置的实际光斑处，以获得一个由九个光斑组成的网格。为测试校准效果，打开标记点窗口，并在样品的新区域手动激活已定义光斑的刺激参数，注意确保标记点窗口中已加载最新的校准文件。然后施加测试脉冲以验证校准是否正确。

为了快速成像并定位感兴趣的亚细胞区域，选择实时扫描，并根据需要增加光学放大倍数以观察微小结构。将标记点单点十字光标放置在细胞膜附近，设置光刺激参数为1至50毫秒持续时间、1至4毫瓦激光功率，并至少设置一次重复。然后选择运行标记点以启动标记点实验程序，并实时观察电生理数据的采集过程。

如图所示，在通过局部施加移液管加压喷射时，一毫摩尔浓度的光激活尼古丁（PA-Nic）的双光子激发（2PE）荧光信号可被轻松检测到。而在相同浓度、激发功率和波长条件下，光激活尼古丁光解反应的主要光化学产物均未产生任何荧光信号，从而证明了光激活尼古丁结果的特异性。

如图所示，将光激活型尼古丁施加于脑组织后进行成像，结果显示药物存在于局部施加移液管周围 100 至 200 微米范围内，证实光激活型尼古丁可通过局部施加有效递送至脑组织。此处展示的高质量图像中，神经元形态完整，噪声被最小化，且碎片不干扰细胞形态的判读。

然而，这些图像质量较低，原因在于信噪比较低以及存在大量碎片。将脑切片中内侧缰核神经元的双光子激光扫描显微成像与PA-Nic的激光闪光光解技术结合使用，如本研究所示，可实现电生理反应与细胞形态学之间的相互印证。

以10秒间隔进行单点光解，可为基线保持电流提供足够的恢复时间。而使用1秒的较短间隔则会导致随着实验方案的进行，保持电流逐渐增加，提示尼古丁在较短时间间隔下未能充分从系统中扩散出去。

在设计使用光可激活分子的实验时，重要的是要选择激发和发射光谱相匹配的荧光指示剂和报告荧光基团。由于PA-Nic具有短波长的光解峰，因此可与大多数常见荧光基团兼容。在选择最合适的PA-Nic应用技术时，必须仔细考虑目标神经元中烟碱型受体的功能表达及其生理活性。

熟练运用该技术可实现对尼古丁施加的精细时空控制，从而为研究天然烟碱型受体的结合动力学、亚细胞定位以及烟碱型受体激活对神经元活动的调控开辟了令人振奋的新途径。