直接注射慢病毒载体突出显示大鼠脊髓中的多条运动通路

病毒载体可将遗传物质导入细胞，以弥补缺陷基因、上调重要的生长蛋白，或制造可用于追踪神经环路的标记物。由于存在固有的生物屏障，将病毒载体导入神经系统具有挑战性。直接注射至脊髓组织可绕过这些屏障，从而实现对细胞体或突触的靶向递送。

准确靶向L1至L4脊髓节段可能较为困难。必须利用解剖标志来确认目标位置，并记住这些节段对应于T11至T13椎骨。在操作当天，将注射器插入微泵中，并将微泵安装至带有游标刻度的显微操作器上。

使用带有柔性针头的注射器，小心地将一种有色染料装入玻璃针中，并将玻璃针插入注射装置。然后确认玻璃针已正确插入垫圈，注射装置的帽已拧紧，且不锈钢注射针已伸出至玻璃针长度的约四分之三。在开始操作前，从冷冻储存中解冻至少一微升病毒液，另加每注射一次所需的少量额外病毒量，并确认麻醉大鼠对脚趾夹捏无反应。

沿动物髋部至肩胛骨下角的背侧中线剃毛，拉紧皮肤以使剃毛更轻松、更精确，并用5%碘溶液和70%乙醇依次擦拭暴露的皮肤进行消毒。在两只眼睛上涂抹眼用软膏。然后将动物置于无菌布上，并在膀胱下方放置纱布以收集任何尿液。

为确定皮肤切口的位置，用手指轻压最后一根肋骨处，以定位第一腰椎（L1）。以该椎骨作为解剖标志，在用手术刀用力按压的同时轻轻牵拉使皮肤绷紧，使用10号手术刀片做一个3至4厘米长的皮肤切口，切口末端位于L1椎骨稍下方，以暴露下方肌肉。使用镊子和剪刀触诊以定位棘突。

在吻侧做小切口，以便用鼠齿镊牢固地夹住上突起。尽可能贴近突起处做两条长而深的切口。固定好侧肌后，清理突起周围的肌肉，以确定其头部的形态。

然后观察棘突头部的形态，以确定椎板切除的位置。T11以及连接处的T12和T13棘突将作为椎板切除的部位。一旦准确定位目标区域，轻轻撑开椎骨以暴露椎间韧带，并使用咬骨钳小块切除棘突及椎骨的背侧部分。

将骨骼从中线处清除，以便观察中线血管，保留一个清晰暴露脊髓组织且无碎屑的窗口。然后将固定镊子夹在椎板切除窗口头侧和尾侧的棘突上，以将动物固定在脊髓固定装置中。并将动物腹部抬高，以消除呼吸运动的影响。

为将病毒装入注射器，用移液器吸取约五微升解冻后的病毒原液，滴加到一片Parafilm上，将玻璃针头置于液滴中，使针尖浸入液滴内。使用微型泵以每秒20至100纳升的速度吸取最多四微升病毒，并将控制器设置为注射模式，然后从针尖释放少量病毒，以确认针头未堵塞。用实验室擦拭纸擦去多余的病毒，并调整显微操作仪的位置，使游标刻度清晰可见。

将针头置于脊髓正中线，使用显微操作仪上的游标刻度将针头向侧方移动 0.8 毫米。然后将针头缓慢下降至脊髓，直至轻压但未穿透硬脊膜，再以快速扭转动作刺穿硬脊膜，使针尖进入深度达 1.5 毫米。针头到位后，设定注射仪以每分钟 400 纳升的速度注入病毒，并通过观察染料前沿的推进情况确认病毒已进入脊髓。

注射完成后，将针头在脊髓内停留两到五分钟，以促进病毒的扩散，然后缓慢拔出针头，移至下一个注射位点。最后一次注射后，将动物从脊柱固定器中取出，以便移除用于撑开侧部肌肉的任何装置。随后使用4.0铬制肠线缝合肌肉，并用九毫米伤口夹钉合皮肤。

成功注射四周后，可在胸段脊髓灰质中观察到对侧（同侧）神经元内显著的GFP表达。在白质中，同侧脊髓的轴突中可见GFP表达，尤其在典型的固有脊髓轴突分布区域。对灰质神经元的高倍放大显示了神经元胞体和树突中典型的信号表达实例。

在脑干核团中，例如脑桥网状结构内，也可以观察到神经元中的GFP表达。成功进行脊髓注射操作的关键因素是准确的椎体定位以及确保病毒进入组织。如果在此操作之前已造成脊髓高位损伤，则可通过直接注射来示踪那些重新建立损伤区域周围连接的神经元。