利用离体共聚焦显微镜观察淋巴结结构及细胞定位

本可重复且易于操作的实验方案采用离体淋巴结成像策略，用于追踪体内给予的荧光标记抗体向局部次级淋巴器官的引流过程。演示该技术可对操作步骤进行具体可视化展示，有助于实验方案的成功实施。该技术非常简单直接，任何人员均可操作。

唯一具有挑战性的环节是小鼠操作，这需要一定的训练。与传统的荧光染色方法相比，该技术具有更快的组织处理速度、更好的组织保存效果以及更高的细胞活性。该操作流程的培训将由实验室技术员 Bruna Tatematsu 负责。

将目标抗体（与适当的荧光染料偶联）在100微升PBS中稀释，用于腹股沟淋巴结成像；或在50微升PBS中稀释，用于腘窝淋巴结成像。对于腹股沟淋巴结成像，将100微升抗体混合液加入配备30号半英寸针头的1毫升胰岛素注射器中，皮下注射至实验小鼠的内侧大腿。对于腘窝淋巴结成像，将50微升抗体混合液皮下注射至实验动物的一只足垫中。

然后将动物放回其饲养盒中。对于腹股沟引流淋巴结的采集，在注射后至少等待三小时，用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，并在腹部皮肤上涂抹矿物油。使用标准显微外科剪刀和显微外科弯镊，从耻骨至剑突沿中线切开腹部皮肤，并将腹壁肌肉组织与皮肤分离。

在垂直切口线的上端和下端做横向皮肤切口，以在注射侧形成皮瓣，并将皮肤牵开以暴露淋巴结。将皮瓣固定在丙烯酸板上，用镊子取出半透明、通常呈双叶状的腹股沟引流淋巴结。对于腘窝引流淋巴结的采集，在注射后至少12小时，将小鼠俯卧位固定在丙烯酸板上。

在动物注射侧的小腿和膝盖部位涂抹矿物油。接着，从小腿后侧的足跟至膝盖做一正中切口，将小腿肌肉组织与皮肤分离。暴露腘窝区域。

腘窝淋巴结将呈现为窝内一个透明的球形结构。然后，使用显微外科弯头镊子将淋巴结取出。为准备成像，将整个器官置于35 mm × 10 mm、带玻璃底的培养皿中，并用镊子清除组织周围的所有脂肪。

将器官置于培养皿中央，并用浸有生理盐水的柔软擦拭纸覆盖组织。对于离体成像，将培养皿放置于倒置共聚焦显微镜的载物台插槽中，使用共聚焦显微镜的常规透射光及 4-10X 物镜获取清晰焦平面。随后从透射光模式切换至激光模式，利用同位素标记、未标记或非荧光样品调节激光功率、偏移量（offset）和增益，以消除自发荧光及非特异性染色信号。

使用4倍、10倍和20倍物镜，以1024 × 1024像素分辨率获取淋巴结结构及细胞分布的图像。然后，使用适当的图像分析软件分离通道，添加比例尺和感兴趣的色彩，并重建三维视图。利用抗CD4和抗CD19抗体对淋巴结细胞进行免疫标记，并结合共聚焦成像分析，可有效定位腹股沟淋巴结中的T细胞和B细胞。

在腘窝淋巴结中，与腹股沟组织类似，B细胞滤泡周围被T细胞群所包绕，这是淋巴结结构的典型特征。如这些图像所示，吞噬细胞并未内化注射的抗体，表明B细胞和T细胞的染色具有特异性。此外，对标记信号的重新构建显示T细胞与B细胞的染色信号不重叠，进一步证实了染色的特异性。

在整个腹股沟淋巴结中，包括被膜下窦，均可见单核细胞。其中大多数单核细胞表达CX3CR1，其次是CCR2和CXCR31CCR2双阳性细胞。在腘窝淋巴结中也观察到相同的细胞分布模式和细胞表型。

两个淋巴结均显示出无单核细胞受体表达的深染区域，这些区域被淋巴细胞占据。此外，单核细胞在淋巴结内部区域中较为稀少，主要集中在组织的外周区域，表明这些细胞主要分布于淋巴结的被膜下窦。为了使淋巴系统将抗体正确引流至淋巴结，必须将抗体混合物精确注射至皮下组织。

该方法可用于荧光标记药物的生物分布研究，以及荧光标记纳米颗粒的细胞靶向研究。