通过无束缚式容积描记法获取衰老小鼠呼吸模式的方法

本方案可用于测量小鼠的呼吸模式。重要的是，它可以最大限度地减少在基因修饰品系中由主动行为带来的影响，从而避免干扰实验结果。该技术的主要优点在于其为非侵入性，且无需使用麻醉剂或引起应激的束缚措施。

首先，确保所有软管和导管均已连接至容积描记室，并将气体流入管和真空流出管直接连接到容积描记室上。为校准进入室内的低流量，将进出室内的流量设置为零，并移除进入室内的流量管。关闭真空泵，在低流量单元格中输入零值，以在容积描记软件的7700型放大器设置中记录零流量状态。

然后重新连接进气管，打开真空气流以校准高流量，并使含20.93%氧气的氮气平衡气体从气体混合器流入容积描记室。接下来，将流量计测得的进气流量值由升/分钟转换为毫升/秒，并点击高流量单位格，输入以毫升/秒为单位的数值。双击高流量校准（high cal），将时间调整为3秒，然后点击测量（Measure）。

然后保持 7700 放大器设置选项卡处于打开状态，以校准代谢分析仪与大气压体积描记软件的匹配。在气体混合程序中，将气体混合器设置为 20.93% 氧气和 79.07% 氮气，以校准代谢分析仪。在代谢分析仪上，将氧气校准水平设为 20.93%，二氧化碳设为 0%。在气体分析仪上输入相应数值后，将旋钮调回“样品”位置，以设定高氧气和低二氧化碳百分比。

单击体积描记软件的 ABCD 4 选项卡，在 C2 行的“高单位”下输入氧气浓度为 20.93。在“高标定”下的时间改为三秒，然后单击“测量”。在 C3 行的“低标定”下，二氧化碳处输入零。

然后将时间更改为三秒，并在低浓度校准下点击“测量”。在气体混合程序中，将氧气值更改为10%，二氧化碳值更改为5%，并等待数分钟，使气体流量调整至这些设定值。在代谢分析仪上，转动调节旋钮，将二氧化碳校准至5%，注意在校准完成后务必将旋钮调回“样品”位置。

确认分析仪读数稳定后，点击 C3 下的高单位，输入二氧化碳值为五。然后将高标定时间改为三秒，点击测量。接着点击 C2 选项下的低单位，输入氧气值为十，点击低标定，输入三秒，然后点击测量。

将气体混合器调回20.93%氧气和79.07%氮气，并等待数分钟，使腔室内的气体浓度稳定至设定值。定期使用经认证的标准气体钢瓶进行额外校准，以确认气体流量混合器以及氧气和二氧化碳分析仪工作正常。完成代谢分析仪的校准后，重新检查连接至容积描记腔室的流量计，并调节进入和流出腔室的空气流速，使其达到适合实验要求的流速。

当所有设置均已应用于容积描记软件后，点击“采集”选项卡中的“关闭”。点击“开始采集”，为文件命名后点击“确定”以开始记录。对于无约束容积描记，应在将小鼠放回其饲养笼之前，记录小鼠的体重和初始体温。

将小鼠放入代谢室之前，等待10分钟以收集空室的背景氧气和二氧化碳数据。在第一个小时内，记录动物的行为，详细记录包括代谢室进出气流的具体数值。在代谢室适应期结束时，观察接下来60分钟内动物安静呼吸的时段，并在使用可植入设备时，每10分钟测量一次体温。

应注意熟悉小鼠的一般行为，以便准确识别小鼠处于平静呼吸、无嗅探、理毛或探索活动的状态。实验结束后，将小鼠放回其笼中，并彻底清洁和擦拭设备。进行代谢分析时，在软件中打开代谢分析面板，获取实验箱为空时前10分钟氧气和二氧化碳水平的平均值。

查看体积描记软件的流量面板，右键单击“分析属性”以设置适当的参数。进行呼吸模式分析时，结合动物行为记录和流量面板的波形图，确认安静呼吸15秒的时间段。然后在数据解析器选项卡中，于“开放解析器”对话框下输入相应时间，并点击“解析器视图模式”，仅显示感兴趣的特定15秒时间段。

为了分析呼吸暂停和深大呼吸，在打开的审阅文件中，退出解析器视图模式，点击 Setup P3 Setup 和 Graph Setup，选择 Page View 作为类型，并将窗格数量设置为五个。在流量测量（单位为毫升/秒）的设置中，将标有 low 的输入框设置为 -2，将标有 high 的输入框设置为 2，然后应用更改。随后滚动至流量轨迹面板的 30 分钟标记处，手动统计小鼠放入呼吸室后 30 至 60 分钟期间的呼吸暂停次数和深大呼吸次数。

在此分析中，持续时间大于或等于0.5秒的呼吸暂停表明存在呼吸暂停事件。增强呼吸表现为呼吸轨迹迅速上升至每秒1.25毫升以上，随后迅速下降至每秒负0.75毫升以下。这条22月龄小鼠安静呼吸的代表性流量追踪曲线，典型地反映了无主动呼吸行为、呼吸节律稳定的呼吸模式。

这种呼吸模式来自小鼠活动较多的阶段，此时小鼠正在探索环境，进行嗅闻和/或理毛行为，因此不适合本方法所采用的呼吸采集类型。用于评估两个时间点之间呼吸模式差异的参数包括：呼吸频率、潮气量、每分钟通气量、潮气量与吸气时间比值，以及每分钟通气量与呼出二氧化碳比值。进一步分析对四个15秒基线阶段分别进行了呼吸频率、潮气量、每分钟通气量、潮气量与吸气时间比值，以及每分钟通气量与呼出二氧化碳比值的计算。

在任何时间点之间均未发现显著差异，且在四种不同时间段内，任何呼吸测量指标的变异性亦无差异。在非限制性容积描记法实验的第30至60分钟期间，对每只动物所观察到的呼吸暂停和深大呼吸次数进行量化分析，结果显示老年动物在30分钟内表现出较高频率的呼吸暂停以及存在深大呼吸现象。研究人员还可采用气体刺激实验，如低氧或高碳酸血症刺激，以记录干预措施或治疗所引起的呼吸模式变化。

该技术为表征小型啮齿类动物及可能表现出独特行为差异的基因修饰动物品系的呼吸模式提供了一种方法。