从小鼠气管中分离和定量评估刷状细胞

我们建立了一种从小鼠气管刷状细胞中分离稀有特化化学感受上皮细胞的方法，这些小鼠来源于胆碱乙酰转移酶荧光报告基因小鼠。该方法首先将气管上皮与黏膜下层分离，从而使上皮层后续与木瓜蛋白酶的孵育时间更短。此方法可高效回收气管刷状细胞，并已成功用于通过RNA测序进行刷状细胞的分离与转录组分析。

长时间孵育消化酶会降低细胞活力，并改变从组织中分离的细胞的转录谱。本文中，我们使用dispase分离气管上皮，随后短时间孵育papain，从而获得大量有活力的刷状细胞。该方法可为上呼吸道上皮的研究提供支持。

相同的方案也可用于分离其他黏膜部位（如鼻腔组织）的刷状细胞。我们高度可重复的技术演示将使同行科学家能够分离并进一步研究气管刷状细胞。开始此操作时，将dispase和DNase I加入PBS中，终浓度如上所示，以配制dispase消化液。

确保在将溶液于37摄氏度水浴中加热前，dispase粉末已完全溶解。接着，在DMEM中加入5%热灭活的FBS，以制备终止溶液。制备Tyrode I缓冲液时，将木瓜蛋白酶（papain）和L-半胱氨酸加入不含钙的HEPES Tyrode缓冲液中。

配制 Tyrode II 缓冲液时，将亮抑蛋白酶肽（leupeptin）加入无钙的 HEPES Tyrode 缓冲液中，终浓度为每毫升缓冲液加入两微升。配制 FACS 缓冲液时，使用不含钙、镁和酚红的 Hank's 平衡盐溶液，并添加 2 毫摩尔 EDTA 和 2% FBS。处死小鼠后，使用 21 号针头将小鼠仰卧位固定于手术板上，四肢充分伸展。

用70%乙醇喷洒毛皮以消毒该区域。使用直镊提起腹部的皮肤和毛皮，用解剖剪在中央做一切口。使用剪刀，从腹部向下颌分离皮肤与皮下组织。

用镊子提起皮下组织，用剪刀在腹壁中央做一个小切口。然后以V形切口打开腹膜。用镊子将小肠轻轻推向一侧。

找到腹主动脉和下腔静脉，用解剖剪进行切口以实现快速放血。找到膈肌。使用18号针头，在胸骨下方的膈肌处穿刺一个小孔，以排出肺部气体。

使用尖头直解剖剪，沿肋骨基部剪开，小心地将膈肌与肋骨分离。用镊子提起暴露的胸骨末端，从肋骨基部向颈部纵向剪开胸骨。使用短直剪刀进行中央颈部切口，并分离下颌下腺的两个叶。

此后，使用一对精细尖头高精度镊子小心去除气管隆突上方的周围结缔组织和胸腺。首先在会厌水平分离气管近端，然后在气管分叉处解剖远端，从而将气管游离。找到会厌，并从会厌沿纵轴向气管隆突方向剪开气管。

首先，将气管放入含有 750 微升预热至 37 摄氏度的分散酶消化液的 1.5 毫升离心管中。用铝箔包裹离心管以减少直接光照，并在 200 转/分钟、室温条件下于摇床上孵育 40 分钟。随后加入 750 微升含 5% 胎牛血清的 DMEM 以终止反应，并将离心管置于冰上。

将气管转移至培养皿中，使气管的上皮面朝上放置。纵向剖开的气管呈由软骨环支撑的半圆柱形。

上皮位于凹面。使用直镊子将气管的会厌区域固定于培养皿上，并用22号一次性手术刀片刮除气管上的上皮。上皮层将作为一个半透明的薄膜分离下来。

使用手术刀将上皮组织切碎，并将上皮层转移至一个 2 毫升离心管中。用 750 微升 Tyrode I 缓冲液冲洗培养皿，并将冲洗液转移至含有上皮层的离心管中。用铝箔包裹离心管，以减少直接光照，然后在 37°C、200 RPM 条件下于摇床中孵育 30 分钟。

然后加入 750 微升冰冷的 Tyrode II 缓冲液。将消化后的组织剧烈涡旋振荡 20 至 30 秒。使用连接 18 号针头的注射器，将匀浆吹打 10 次。

此后，更换为21号针头，再吹打10至20次。将细胞通过100 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。按30:1的体积比加入预冷的FACS缓冲液。

在 350 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于冷 FACS 缓冲液中。将此悬液转移至 12 × 75 毫米的聚苯乙烯管中。

再次在350 × g、4 °C条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL FACS缓冲液中。接着，加入1 µL抗小鼠CD1632封闭抗体以阻断非特异性结合，并在冰上孵育15分钟。

然后根据文本方案中所述，在相应的同型对照中加入抗体。置于冰上避光孵育45分钟。之后，加入4.5毫升冷的FACS缓冲液并混匀。

在 350 × g 和 4 °C 条件下离心。弃去上清液，并将沉淀重悬于 300 µL 冷的 FACS 缓冲液中。在流式细胞分选前立即加入碘化丙啶。

本研究成功分离了来自 ChAT eGFP 乙酰胆碱荧光报告小鼠的气管刷状细胞，用于 RNA 测序。通过前向散射和侧向散射角度将细胞与碎片区分开来。利用前向散射高度与宽度以及侧向散射高度与宽度排除双联体细胞。

双峰细胞是具有较高宽度值的细胞。在单细胞中，活细胞被鉴定为碘化丙啶阴性群体。在活的单细胞中，CD45低至阴性细胞根据同型对照进行鉴定。

在 CD45 低表达的阴性细胞中，同时在 FITC 通道中呈 eGFP 阳性且为 EpCAM 阳性的细胞即为刷状细胞群体。刷状细胞的数量会因微生物代谢产物和原生动物的暴露而发生变化，因此反映了不同机构动物群中微生物组的差异性。因此，我们建议通过荧光显微镜估算刷状细胞数量，以预测通过流式细胞分选所能获得的刷状细胞数量。

务必正确分离气管的上皮层，因为这决定了分离刷状细胞的得率。分离得到的气管刷状细胞可用于多种实验，如RNA测序、细胞培养和功能分析。