在小鼠中诱导根尖周炎

本方案能够在一种易于操作且可控的小鼠模型中研究根尖周牙周炎，因此相较于患者样本或体外模型具有优势。该技术的主要优点在于小鼠已被广泛研究，且该方法在设备需求方面技术简单，成本效益高。

由于牙齿尺寸较小，该操作具有一定难度，因此通过可视化方式展示该技术的操作过程，有助于学习者了解其定位方法和具体实施步骤。在确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将小鼠置于惯用的一侧手边，仰卧于闭孔挤塑聚苯乙烯泡沫表面，并用胶带固定其四肢。使用单根橡皮筋套住一对门齿，并借助固定在闭孔挤塑聚苯乙烯泡沫表面的长针，将小鼠口腔撑开。

使用固定在泡沫上的闭合镊子牵拉右侧颊部。将泡沫和小鼠置于显微镜和光源下。然后用牙科刮匙牵拉舌头，并用27号针头将25至50微升局部麻醉剂注射到下颌第一磨牙附近的颊黏膜皱襞处。

应观察注射部位周围的组织肿胀情况。为暴露牙髓，可使用配备圆形高速金刚砂钻头（直径0.8毫米）的合适牙科手机，在每分钟800转的速度下钻磨右下颌第一磨牙的咬合面，直至通过牙本质可见牙髓角。使用8号或10号K锉或H锉刺穿牙髓，并破坏覆盖近中和远中牙髓角的牙本质，以便将锉插入牙髓角内。

尽可能深入地使用锉刀处理牙髓腔内的组织，同时用锉刀扩大开口，通常会在牙体锐利边缘周围观察到牙髓出血现象，使用裂钻修整牙齿以脱离咬合接触，从而减轻实验过程中的疼痛。使用微型刷清洁任何碎屑。将对侧左侧下颌第一磨牙保留作为对照。

术后前3天，每天称量动物体重，并按0.1毫克/千克剂量经腹腔注射布托啡诺一次。在随后的42天内，每周两到三次通过称重及一般行为评估继续监测动物状况。在整个随访期间，将用水软化的食物颗粒置于培养皿中，放置于笼底供动物摄食。

实验结束时，使用手术剪刀和镊子采集包含治疗侧和非治疗侧三颗磨牙的下颌部分。用镊子尽可能剥离大部分软组织，使样本上主要保留骨组织和牙齿。用 PBS 短暂冲洗组织。

在4%多聚甲醛中固定24至48小时之前。然后用新鲜的PBS冲洗样品三次。进行显微计算机断层扫描（Micro-Computed Tomography，或Micro-CT）分析时，将收获的组织置于直径12毫米的试管中，内含1.5毫升PBS，并放置于扫描仪载物台上。

将样本放置成牙齿及牙根的颊侧或舌侧表面与管底平行。使用海绵将样本隔开，并用柔性薄膜覆盖管口。

选择控制文件，将能量设置为70千伏，电流设置为114微安，分辨率设置为6微米立方的体素尺寸。点击Scout-View。当图像出现后，点击Reference-Line并标记样品的扫描区域，每个样品标记后点击Add Scan。

当所有样本标记完成后，进入任务列表，选择“开始交互任务”。对于显微CT切片的勾画，选择大致位于牙齿中部的切片，该切片应包含冠部牙髓、两个根管的根部牙髓以及两个根尖孔。点击轮廓面板，从远中根尖的远端点开始，沿远中根的近中边缘、经根分叉区域，沿近中根的远中边缘，至近中根尖的近中边缘，再向冠方延伸至根尖周致密骨区域，标记根尖边界。

复制并粘贴生成的轮廓，并相应地调整位于中间切片两侧的五个切片上的轮廓。要计算每个样本所标记轮廓的组织体积，请在“Micro-CT Evaluation”中选择“Task”，然后点击“3D-Evaluation”。随后，在“3D-Evaluation”窗口中点击“Select”，并选择一个滤波器以计算组织体积。

微型CT分析结束后，将组织从扫描仪转移至含有1毫升EDTA的微量离心管中，脱钙10天。脱钙结束后，将样本放入组织学包埋盒中，并依次置于浓度递增的乙醇中浸泡，每个浓度1小时。第二次乙醇浸泡后，将样本转移至二甲苯中，进行两次，每次一小时。在将包埋盒转移至化学通风橱中60摄氏度的液态石蜡中过夜之前，确保二甲苯充分挥发。

次日早晨，将脱水后的样本置于组织包埋机中，使牙冠和牙根方向与模具底部平行，以进行石蜡包埋。为获得切片，将石蜡包埋的样本固定在切片机的切片台上，修块至目标组织暴露。当牙齿的任何部分可见时，开始切取6 µm厚的切片，并调整切面角度，直至获得包含冠髓、根髓及根尖孔的矢状切片为止。

此处显示的是经过处理的完整下颌骨。对右侧第一磨牙进行放大后，可观察到近中和远中髓角的暴露情况以及根管的入口。显微CT成像能够清晰显示近中髓腔的暴露区域，以及近中和远中根尖周骨吸收所形成的透射区。

事实上，与对照组相比，治疗组牙齿的根尖周组织体积显示出显著的骨吸收。组织学分析表明，在治疗组牙齿中，牙髓组织本身出现坏死，经H和E染色后，与对照组结构完整的牙髓组织相比，这一现象清晰可见。此外，尤为重要的是，在治疗组牙齿的根尖周区域，观察到由免疫细胞构成的根尖周病损，而对照组牙齿中则无此现象。

在进行牙髓暴露时，正确固定小鼠体位至关重要，因为正确的体位能够便于良好地接触动物口腔，从而获得理想的结果。在本方案基础上，还可进一步开展其他根尖周炎症分析方法，如免疫组织化学染色、 Fax 以及对细胞进行详细的分子分析。该方案不仅对牙科研究具有重要意义，也对免疫学研究具有重要价值，因为它提供了一种具有内置内部对照的局部诱导炎症模型。